ИСТИНА

Фундаментальной проблемой, на решение которой направлен данный проект, является изучение молекулярных взаимодействий в супрамолекулярных комплексах биополимеров, в том числе и в процессе их реорганизации. Конкретной задачей исследования является фиксация короткоживущих белок-белковых и белково-нуклеиновых комплексов с помощью реакционноспособных соединений и определение структуры полученных конъюгатов. В ходе работы будут синтезированы фрагменты ДНК и РНК с 2'-дезокси-2'-аминонуклеозидными вставками. Эти функциональные группы будут локализованы в различных позициях олигонуклеотида с последующим превращением их в активные центры, нацеленные на связывание с остатками цистеина белка (например, йодацетамидная, малеимидная, дисульфидные группы). Предполагается синтезировать реакционноспособный НК-реагент на аргинин. С этой целью будет осуществлен синтез и изучены некоторые свойства нового класса соединений – олигонуклеотидов, содержащих бета-дикетогруппу при С2'-атоме углеводного фрагмента. Будет осуществлен дизайн и синтез олигонуклеотидных реагентов, взаимодействующих с остатками лизина и обладающих различной реакционной способностью. В качестве простейшего белкового объекта – модели для проверки селективности и специфичности новых ДНК-реагентов, направленных на остатки лизина и аргинина белка, будет использована эндонуклеаза рестрикции SsoII. РНК-белковый "кросслинкинг" новыми реагентами будет первоначально изучен на простой и хорошо охарактеризованной системе – комплексе М-домена белка Ffh из E. coli с его минимальным РНК-субстратом длиной 49 нуклеотидных звеньев. Отработанная методика "кросслинкинга" будет затем применена для изучения более сложных белково-нуклеиновых комплексов гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции BspD6I и белков системы репарации неканонических пар с ДНК, а также рибонуклеазы PRORP1 с пре-тРНК. Для фиксации белок-белковых комплексов, образующихся при функционировании изучаемых систем, будет протестирован широкий набор гомо- и гетеробифункциональных реагентов. При выполнении проекта будет использоваться метод масс-спектрометрии MALDI. Планируется оптимизировать состав матрицы, отработать приемы проведения анализа, позволяющие эффективно решать нетривиальную задачу по одновременной идентификации фрагментов ДНК и полипептидных цепей. Результатом работы будет характеристика структуры и изучение функционирования системы репарации неканонических пар в ДНК и иерархии взаимодействий белковых компонентов этой системы, а также установление механизмов узнавания и гидролиза нуклеиновых кислот гетеродимерной эндонуклеазой рестрикции BspD6I и рибонуклеазой PRORP1.

Ковалентное специфичное присоединение белков к ДНК и РНК позволяет не только изучать детали НК-белковых взаимодействий, но и понять особенности функционирования сложных динамических белковых ансамблей, взаимодействующих с НК за счет фиксации одного из компонентов на НК. Работа по созданию новых реагентов для тестирования НК-белковых контактов проводилась в двух направлениях. Первое направление заключалось в расширении набора аминокислотных остатков в составе белковой молекулы, селективно реагирующих с химически активной группировкой в НК. Второе направление связано с дизайном и синтезом олигонуклеотидных реагентов нового типа, нацеленных на остатки цистеина и аргинина белка. При дизайне ДНК-реагентов, взаимодействующих с определенной аминокислотой белка должны выполняться следующие требования: 1) модифицированная ДНК должна быть реакционноспособной; 2) реакция должна проходить в составе специфического комплекса и 3) быть региоселективной. В ходе выполнения проекта были предложены новые и протестированы уже существующие реакционноспособные ДНК, а именно: малеимидная и акриламидная группировки, присоединенные с помощью линкеров различной длины к пятому положению гетероциклического основания 2'-дезоксиуридина; бета-дикетопроизводные различной структуры, связанные с 2'-аминогруппой 2'-амино-2'-дезокиуридина; иодацетамидная и пиридилдисульфидная группировки, модифицирующие в составе линкера 2'- положение углеводного фрагмента. В качестве объектов исследования были выбраны белок системы репарации неканонических пар нуклеозидов MutS E coli, большая субъединица гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции BspD6I (никаза BspD6I), а также в качестве контролей другие белки, взаимодействующие с ДНК. Проведенный анализ эффективности и специфичности химической реакции между модифицированными фрагментами нуклеиновой кислоты и белками-партнерами позволил сделать вывод о целесообразности применения той или иной химически активной группировки для образования ковалентного НК-белкового комплекса.