![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Строение и функции рибосомных РНК (рРНК), составляющих более 80% всей клеточной РНК, изучаются уже не одно десятилетие, однако молекулярные механизмы их работы в рибосоме не известны. Рибосома обладает несколькими функциональными центрами, построенными преимущественно или исключительно из сегментов рРНК. Работа этих центров строго скоординирована, что достигается, как это выяснилось в последние годы, путем передачи сигналов от одного центра к другому. Поскольку расстояние между функциональными центрами рибосомы существенно превышает их размеры, можно предположить, что передача функциональных сигналов в ходе трансляции генетической информации осуществляется аллостерически путем направленных локальных изменений в структуре рРНК. В результате выполнения проекта предполагается выяснить механизм участия рРНК в такой передаче сигнала. Еще один объект настоящего исследования – теломеразная РНК, которая необходима организму для поддержания целостности хромосом. Планируется определить, существует ли у теломеразной РНК какая-либо еще функция помимо основной. Необходимым этапом является также выяснение особенностей функционирования только что открытой нкРНК D. rerio, названной TREPRA (Telomere Repeat RNA), которая закодирована в областях генома, окруженными инвертированными теломерными повторами. Расположенный на обоих концах геномной РНК ВИЧ-1 TAR (trans-activation response) элемент участвует во многих процессах репродукции вируса. Из всего множества функций TAR РНК в проекте предполагается исследовать роль TAR РНК в процессе активации транскрипции интегрированного вирусного генома в латентной фазе, а также оптимизировать структуру и метод внутриклеточной доставки ранее сконструированного ингибитора взаимодействия TAR РНК с ее ДНК-копией на начальном этапе обратной транскрипции. В проекте также запланировано исследование двух малоизученных бактериальных нкРНК - TRAR (tRNA-associated RNA) и 6S РНК с целью выяснения функциональной роли этих загадочных молекул. Скорее всего, роль TRAR связана с функционированием тРНК, поскольку гены TRAR всегда следуют за генами тРНК. Для изучения свойств и функций 6S РНК будут выделены новые 6S РНК из различных бактерий, в том числе из патогенной L. monocytogenes.
Regulation of intracellular processes by non-coding RNAs (ncRNAs) is a vast and insufficiently explored field of molecular and cell biology. Recently, the number of publications in high-rating journals devoted to the ncRNA structure and biological role has demonstrated an explosive growth testifying a huge interest to this field. Next generation sequencing techniques allowed for identifying an extraordinary diversity of RNA transcripts which do not code for proteins. Studying ncRNA functional role may lead to a discovery of fundamentally new molecular mechanisms of living systems functioning. In the present project, we propose studying a set of ncRNAs with established functions (ribosomal RNA, telomerase RNA and TAR RNA of human immunodeficiency virus (HIV-1)) as well as with unknown functions (bacterial ncRNAs TRAR and 6S, RNA TREPRA from Danio rerio) using several new methodological approaches. Structure and function of ribosomal RNAs (rRNAs) which constitute more that 80% of all cellular RNA have been under investigation for several decades; however, the molecular mechanisms of their functioning remain unknown. Ribosome has several functional centers built predominantly or purely of rRNA segments. Functioning of these centers is strictly coordinated; this is attained by a signal transmission from one center to another, as has been found during the last years. Since the distance between the ribosome functional centers is significantly larger than their dimensions, one could suppose that the functional signals transmisson during translation is performed allosterically via directed local changes in rRNA structure. As a result of the project, we propose to clarify the mechanism of rRNA participation in such signal transmission. The second object of the present study is telomerase RNA which is necessary for the organism for maintaining chromosome ends integrity. We propose to find if the telomerase RNA has another function in addition to the main one. The necessary step is to clarify functioning peculiarities of a ncRNA just found in D. rerio and named TREPRA (Telomere Repeat RNA). TREPRA is encoded in the genome regions, surrounded by inverted telomeric repeats. The TAR (trans-activation response) element which is situated on both ends of HIV-1 genomic RNA participates in many processes of the virus reproduction. Out of numerous TAR functions, we propose to investigate the TAR role in the activation of the integrated viral genome transcription during the latent phase. We also plan to optimize the structure and the method of intracellular delivery of the previously constructed inhibitor which prevents TAR binding to its DNA copy during the initial step of the reverse transcription. A study of two insufficiently explored bacterial RNAs is proposed in this project, namely TRAR (tRNA-associated RNA) and 6S RNA. The purpose is to clarify functional roles of these enigmatic molecules. Most likely, the TRAR role is connected with tRNA functioning, since it is encoded by genes which always follow the tRNA genes. The properties and functions of new 6S RNA from different bacteria (including the pathogenic L. monocytogenes) will be studied.
В рамках изучения функциональной роли нкРНК выбраны несколько конкретных молекул с совершенно разными функциями. Реализация проекта может привести как к открытию новых механизмов регуляции в живых системах, так и найти новые мишени для терапии. В проекте будет определена функциональная роль ранее не изученных малых нкРНК (TRAR и 6S) в бактериальных клетках. Можно ожидать, что TRAR РНК физически и/или функционально взаимодействуют с тРНК. Такое взаимодействие будет первым примером регуляции активности тРНК с помощью нкРНК. В рамках проекта впервые будет установлена функция других бактериальных нкРНК – 6S РНК из L. monocytogenes, B. japonicum и R. sphaeroides. Есть основания предполагать, что в перечисленных бактериях 6S РНК является ингибитором РНК- полимеразы и таким образом регулирует экспрессию некоторых генов. Планируется оценить значение 6S РНК для вирулентности L. monocytogenes и дифференцировать роли 6S-1 и 6S-2 РНК из B. subtilis. Будет изучен механизм участия рРНК в обмене сигналами между функциональными центрами рибосомы с использованием полученных в последние годы структур высокого разрешения как самой рибосомы, так и ее комплексов с лигандами, участвующими в биосинтезе белка, и антибиотиками, его ингибирующими. Любые новые данные об участии бактериальных нкРНК в регуляции клеточных процессов представляют огромный интерес для медицины, поскольку эти РНК могут служить потенциальными мишенями для новых антибактериальных препаратов. Новые представления относительно TAR РНК ВИЧ-1 позволят разрабатывать ранее неизвестные подходы для антиретровирусной терапии. Будет исследована роль TAR и ее клеточных партнеров в активации экспрессии «спящего» интегрированного генома ВИЧ-1 (в латентной фазе). Взаимодействие TAR РНК с ее ДНК-копией необходимо для успешного синтеза ДНК-копии геномной РНК вируса; его ингибирование подавляет весь процесс репликации ВИЧ-1. Будет оптимизирована структура ранее сконструированного ингибитора взаимодействия TAR РНК с ее ДНК-копией, а также метод его доставки в клетку. Важным является ответ на вопрос – обоснованно ли теломеразная РНК отнесена к нкРНК, поскольку есть веские основания ожидать наличия у нее альтернативной функции. Будут получены данные, которые позволят уточнить механизм участия непосредственно теломеразной РНК в системе ограничения длины теломер. Будет проведен анализ, позволяющий подтвердить уникальность только что найденной нкРНК D. rerio TREPRA и предполагаемый механизм ее действия. По предварительным данным эта РНК участвует в образовании специфических структур, регулирующих структурную организацию хроматина, в ядрах отдельных типов клеток. Мы предполагаем, что эта РНК участвует в регуляции тканеспецифической экспрессии областей генома. Новые представления об альтернативных функциях теломеразной РНК и механизме ее регуляции, а также понимание механизмов тканеспецифической регуляции экспрессии генов позволят разработать новые и скорректировать существующие подходы при выборе мишеней антираковой терапии.
На кафедре были впервые разработаны широко применяемые сейчас в мире методы направленного расщепления РНК с помощью РНКазы Н, оригинальные методы ковалентного связывания РНК с белками. Все эти методы успешно применялись в ходе изучения функциональной топографии отдельных элементов рибосомной РНК в рибосоме. У коллектива исполнителей есть достаточный опыт работы в области функциональной геномики бактерий. Нашим коллективом была установлена неизвестная ранее функция 6 генов E. сoli. В рамках исследования свойств и функций 6S РНК в клетках B. subtilis участниками проекта впервые была экспериментально подтверждена способность 6S-1 и 6S-2 РНК ингибировать транскрипцию генов и влиять на уровень экспрессии различных белков. Таким образом, была подтверждена теоретическая модель функционирования 6S РНК в клетке. Коллектив обладает значительным опытом в области синтеза аминокислотных и пептидных аналогов рибосомных антибиотиков и изучения их комплексов с бактериальными рибосомами, а также опытом молекулярно-динамических расчетов комплексов макролидов с различными бактериальными рибосомами. Участники проекта в течение ряда лет разрабатывают методы автоматического синтеза модифицированных фрагментов ДНК и РНК, их использования для получения конъюгатов различной структуры, а также аффинной модификации белков. Эти соединения зарекомендовали себя как уникальные инструменты исследования белково-нуклеиновых взаимодействий и модуляторы активности НК-связывающих белков. Установлено, что короткие олигонуклеотиды, содержащие галогенированные производные флуоресцеина, ингибируют активность двух ферментов ВИЧ-1, интегразы и обратной транскриптазы. Имеется опыт работы с клетками высших эукариот, необходимый для изучения альтернативных функций TER. Отработаны классические методы оценки эффективности работы теломеразы по длине теломер, методы геномных манипуляций для термотолерантных дрожжей
В ходе выполнения проекта было показано существование нового класса РНК – TRAR РНК, гены этих РНК располагаются после генов тРНК и содержат последние 18-19 нуклеотидов расположенной перед ними тРНК. Экспрессия TRAR РНК трех различных оперонов tyrTV, serX и lysT-Q была проанализирована при помощи метода количественного ПЦР. TRAR РНК оперона lysT-Q присутствуют в клетках в концентрации, сравнимой с концентрацией соответствующей тРНК, концентрация tyr TRAR в десять раз меньше концентрации соответствующей тРНК, при этом ser TRAR не удалось детектировать. Для tyr и lys TRAR были определены 5'- и 3'-концы РНК. 5'-Конец TRAR РНК образуется в результате 3'-процессинга расположенной перед ним тРНК, 3'-конец TRAR РНК в большинстве случаев - CCA, такой же как и у тРНК. Также нам удалось показать, что процессинг 3'-конца TRAR РНК происходит независимо от процессинга тРНК. Был проведен биоинформатический поиск TRAR РНК среди небольшого набора энтеробактерий. Среди одиннадцати различных штаммов только tyr TRAR РНК была найдена во всех организмах, другие TRAR могут быть найдены в половине анализируемых организмов. Последовательность TRAR очень консервативна (не менее, чем тРНК), и в конкретном организме TRAR больше похожи друг на друга, чем соответствующие тРНК. Моделирование вторичной структуры позволило найти консервативные мотивы во всех TRAR РНК. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции является одним из важнейших механизмов в клетках прокариот. Оказалось, что малые некодирующих РНК, так называемые 6S РНК, способны ингибировать транскрипцию за счет непосредственного связывания с холоферментом РНК-полимеразы и блокирования её активного центра. Кроме E. coli наличие гена 6S РНК предполагается более чем в 130-ти видах бактерий, но только для 16-ти из них этот факт подтвержден экспериментально. Немногочисленные данные, известные для 6S РНК из этих бактериальных систем, свидетельствуют о возможном отличии свойств и функций их 6S РНК от 6S РНК E. coli. Наиболее интересным фактом является существование двух различных 6S РНК (6S-1 и 6S-2) в грамположительной бактерии Bacillus subtilis. Причины «появления» дополнительной 6S-2 РНК в условиях активного роста и деления клеток, а также её свойства и функции неизвестны и будут детально исследованы. Аналоги 6S РНК были найдены и в клетках высших эукариот – Alu РНК человека и B2 РНК мыши. Общность функциональных свойств этих нкРНК позволяет использовать 6S РНК B. subtilis в качестве модели для понимания основ нкРНК-зависимых механизмов регуляции транскрипции. В рамках данного проекта впервые показано, что делеции генов bsrA и bsrB, кодирующих 6S-1 и 6S-2 РНК, влияют на экспрессию белков в клетках B. subtilis. Идентифицировано 35 белков, содержание которых в клетке возрастает в отсутствие 6S-1 и/или 6S-2 РНК. Установлено, что ингибирование экспрессии белков AroA, Mdh, CysK, MntA, YvyD, AhpC, YjcG, YgaF, YraA, RplJ, GreA и Tpx может быть вызвано влиянием как 6S-1, так и 6S 2 РНК. Повышение уровня экспрессии белков Pyk и PdhB наблюдалось только при делеции гена bsrA. Регуляция остальных идентифицированных белков осуществляется главным образом посредством 6S-2 РНК. Функции большинства выявленных белков связаны с процессами метаболизма в условиях окислительного стресса, аминокислотного голодания и холодового шока. Показано, что условия аэрации клеточной культуры влияют на скорость роста R. sphaeroides. Впервые показано, что профиль экспрессии 6S РНК R. sphaeroides отличается от 6S РНК E. coli. Максимальная концентрация 6S РНК R. sphaeroides приходится на стадию перехода из экспоненциальной в стационарную фазу роста клеток. В стационарной фазе уровень экспрессии 6S РНК R. sphaeroides заметно снижается. Таким образом, единственная 6S РНК R. sphaeroides имеет схожий профиль экспрессии с 6S-2 РНК B. subtilis. Среднее время жизни 6S РНК R. sphaeroides в клетке составляет более 4 ч, что косвенно указывает на формирование комплекса этой 6S РНК с РНК-полимеразой. С целью выяснения природы аллостерических взаимодействий между различными функциональными центрами рибосомы, лежащих в основе процессов регуляции трансляции, а также механизма работы антибиотиков, воздействующих на рибосомный туннель (РТ), были проведены молекулярно-динамические (МД) исследования рибосомы, а также был выполнен синтез пептидных производных хлорамфеникола, в которых антибиотик связывается с А-сайтом пептидилтрансферазного центра, а пептидный остаток направлен в РТ в район сенсорных нуклеотидов. МД исследования были направлены на детальный анализ конформационной подвижности сегмента стенки туннеля рибосомы E. coli, образованного участком 2058-2063 полинуклеотидной цепи 23S рРНК, а также примыкающим к нему в третичной структуре рибосомы модифицированным нуклеотидным остатком m2A2503. Этот сегмент макромолекулы 23S рРНК рассматривается в литературных источниках как один из наиболее вероятных участников процесса передачи функциональных сигналов из внутренних районов РТ в ПТЦ рибосомы. В результате анализа молекулярно-динамических траекторий для исследуемой системы нами были обнаружены конформационные переходы, затрагивающие как нуклеотидные остатки изучаемого сегмента РТ (A2058, A2059, C2063, G2061, A2062), так и некоторые нуклеотидные остатки, участвующие в функционировании ПТЦ рибосомы (U2585). Для изучения функциональных сигналов рРНК экспериментальными методами синтезированы трипептидные производные хлорамфеникола. Структуры производных хлорамфеникола были выбраны на основе виртуального скрининга комплексов всех трипептидных производных хлорамфеникола с 50S субъединицей рибосомы E. сoli. Для оптимизации структуры олигонуклеотидных ингибиторов взаимодействия TAR РНК и кTAR синтезированы производные олигонуклеотидного ингибитора взаимодействия TAR РНК и кTAR, содержащие на 3’-конце гидрофобные остатки холестерина или олеиновой кислоты. Для исследования транспорта этих производных в клетки на их 5’-конец присоединен флуорофор гексахлорфлуоресцеин. Соединение, содержащее остаток олеиновой кислоты, в клетки практически не проникало. Олигонуклеотид, конъюгированный с холестерином, в основном связывался с клеточными мембранами, однако часть его проникала в цитоплазму, где локализовалась в виде точечных структур, предположительно в эндосомальных пузырьках. Теломераза – фермент, удлиняющий концы линейных хромосом эукариот (теломеры). Теломеры защищают концы хромосом от потери генетической информации в результате укорочения в каждом раунде клеточного деления. Теломераза человека активна в половых, стволовых, эмбриональных клетках. По мере развития организма и дифференцировки клеток происходит инактивация этого фермента. Теломераза неактивна в соматических клетках, но в большинстве раковых клеток активность фермента восстанавливается. Два основных компонента: теломеразная РНК и теломеразная обратная транскриптаза – входят в состав активного холофермента. Экспрессия теломеразной обратной транскриптазы тонко регулируется на разных этапах жизни клеток. Теломеразная РНК экспрессируется постоянно, она очень стабильна и находится практически во всех клетках человеческого организма. Первоначально теломеразная РНК была открыта как некодирующая РНК. Она содержит матрицу для синтеза теломер, а также является структурным каркасом для фермента. Анализ первичной структуры теломеразной РНК позволил предположить кодирующий потенциал этой РНК. Мы выявили открытую рамку считывания, входящую в состав первичного транскрипта гена теломеразной РНК. На данном этапе в рамках выполнения работ по проекту, используя масс-спектрометрический подход, мы получили прямые доказательства наличия эндогенного белка hTERP в клетках человека. Одно из направлений проекта – исследование функций теломеразной РНК (TER), альтернативных функциям матрицы для синтеза теломерных повторов и платформы для сборки теломеразного комплекса. В 2013 году на кафедре химии природных соединений на модельном организме было показано, что TER может участвовать в процессе ограничения длины теломер. Это новая функциональная особенность теломеразной РНК и первый случай, когда система ограничения длины теломер закодирована непосредственно в теломеразной РНК. Мы предположили возможный контроль этого процесса особой структурой в теломеразной РНК. Для доказательства этого необходимо было разработать эффективный метод тестирования процесса, не основанный на глубоком секвенировании. Такой метод был разработан и опробован, что, возможно, позволит на следующем этапе проверить предположительные дополнительные детерминанты этого процесса в структуре теломеразной РНК модельного организма, оценить возможность их поиска в теломеразной РНК человека и спланировать способы влияния на этот процесс. Искусственное восстановление любой системы ограничения длины теломер – это возможность ограничить количество делений опухолевой клетки с активной теломеразой. Ранее на модельном организме D. rerio нами было показано, что некоторые внутренние участки генома, которые ограничены инвертированными теломерными повторами, транскрипционно активны. Так была выявлена новая длинная некодирующая РНК TREPRA (Telomere Repeat RNA), которая транскрибируется с участка генома, ограниченного внутренними теломерными повторами, ассоциированными с повторяющимися элементами генома. На культуре фибробластов этого организма нами было показано, что TREPRA образует специфические кластерные структуры в ядрах, морфология которых изменяется в стареющих фибробластах. На данном этапе проекта похожие РНК-зависимые структуры, в формировании которых принимает участие TREPRA, были выявлены также на срезах эмбрионов D. rerio. Таким образом, впервые было показано наличие подобных РНК-кластеров не только в культуре клеток, но и в организме D. rerio. Этот факт делает осмысленным экспериментальный поиск гомологов этой РНК у человека.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 9 октября 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Некодирующие РНК: изучение механизмов функционирования и поиск потенциальных мишеней для терапии |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта было показано существование нового класса РНК – TRAR РНК, гены этих РНК располагаются после генов тРНК и содержат последние 18-19 нуклеотидов расположенной перед ними тРНК. Экспрессия TRAR РНК трех различных оперонов tyrTV, serX и lysT-Q была проанализирована при помощи метода количественного ПЦР. TRAR РНК оперона lysT-Q присутствуют в клетках в концентрации, сравнимой с концентрацией соответствующей тРНК, концентрация tyr TRAR в десять раз меньше концентрации соответствующей тРНК, при этом ser TRAR не удалось детектировать. Для tyr и lys TRAR были определены 5'- и 3'-концы РНК. 5'-Конец TRAR РНК образуется в результате 3'-процессинга расположенной перед ним тРНК, 3'-конец TRAR РНК в большинстве случаев - CCA, такой же как и у тРНК. Также нам удалось показать, что процессинг 3'-конца TRAR РНК происходит независимо от процессинга тРНК. Был проведен биоинформатический поиск TRAR РНК среди небольшого набора энтеробактерий. Среди одиннадцати различных штаммов только tyr TRAR РНК была найдена во всех организмах, другие TRAR могут быть найдены в половине анализируемых организмов. Последовательность TRAR очень консервативна (не менее, чем тРНК), и в конкретном организме TRAR больше похожи друг на друга, чем соответствующие тРНК. Моделирование вторичной структуры позволило найти консервативные мотивы во всех TRAR РНК. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции является одним из важнейших механизмов в клетках прокариот. Оказалось, что малые некодирующих РНК, так называемые 6S РНК, способны ингибировать транскрипцию за счет непосредственного связывания с холоферментом РНК-полимеразы и блокирования её активного центра. Кроме E. coli наличие гена 6S РНК предполагается более чем в 130-ти видах бактерий, но только для 16-ти из них этот факт подтвержден экспериментально. Немногочисленные данные, известные для 6S РНК из этих бактериальных систем, свидетельствуют о возможном отличии свойств и функций их 6S РНК от 6S РНК E. coli. Наиболее интересным фактом является существование двух различных 6S РНК (6S-1 и 6S-2) в грамположительной бактерии Bacillus subtilis. Причины «появления» дополнительной 6S-2 РНК в условиях активного роста и деления клеток, а также её свойства и функции неизвестны и будут детально исследованы. Аналоги 6S РНК были найдены и в клетках высших эукариот – Alu РНК человека и B2 РНК мыши. Общность функциональных свойств этих нкРНК позволяет использовать 6S РНК B. subtilis в качестве модели для понимания основ нкРНК-зависимых механизмов регуляции транскрипции. В рамках данного проекта впервые показано, что делеции генов bsrA и bsrB, кодирующих 6S-1 и 6S-2 РНК, влияют на экспрессию белков в клетках B. subtilis. Идентифицировано 35 белков, содержание которых в клетке возрастает в отсутствие 6S-1 и/или 6S-2 РНК. Установлено, что ингибирование экспрессии белков AroA, Mdh, CysK, MntA, YvyD, AhpC, YjcG, YgaF, YraA, RplJ, GreA и Tpx может быть вызвано влиянием как 6S-1, так и 6S 2 РНК. Повышение уровня экспрессии белков Pyk и PdhB наблюдалось только при делеции гена bsrA. Регуляция остальных идентифицированных белков осуществляется главным образом посредством 6S-2 РНК. Функции большинства выявленных белков связаны с процессами метаболизма в условиях окислительного стресса, аминокислотного голодания и холодового шока. Показано, что условия аэрации клеточной культуры влияют на скорость роста R. sphaeroides. Впервые показано, что профиль экспрессии 6S РНК R. sphaeroides отличается от 6S РНК E. coli. Максимальная концентрация 6S РНК R. sphaeroides приходится на стадию перехода из экспоненциальной в стационарную фазу роста клеток. В стационарной фазе уровень экспрессии 6S РНК R. sphaeroides заметно снижается. Таким образом, единственная 6S РНК R. sphaeroides имеет схожий профиль экспрессии с 6S-2 РНК B. subtilis. Среднее время жизни 6S РНК R. sphaeroides в клетке составляет более 4 ч, что косвенно указывает на формирование комплекса этой 6S РНК с РНК-полимеразой. С целью выяснения природы аллостерических взаимодействий между различными функциональными центрами рибосомы, лежащих в основе процессов регуляции трансляции, а также механизма работы антибиотиков, воздействующих на рибосомный туннель (РТ), были проведены молекулярно-динамические (МД) исследования рибосомы, а также был выполнен синтез пептидных производных хлорамфеникола, в которых антибиотик связывается с А-сайтом пептидилтрансферазного центра, а пептидный остаток направлен в РТ в район сенсорных нуклеотидов. МД исследования были направлены на детальный анализ конформационной подвижности сегмента стенки туннеля рибосомы E. coli, образованного участком 2058-2063 полинуклеотидной цепи 23S рРНК, а также примыкающим к нему в третичной структуре рибосомы модифицированным нуклеотидным остатком m2A2503. Этот сегмент макромолекулы 23S рРНК рассматривается в литературных источниках как один из наиболее вероятных участников процесса передачи функциональных сигналов из внутренних районов РТ в ПТЦ рибосомы. В результате анализа молекулярно-динамических траекторий для исследуемой системы нами были обнаружены конформационные переходы, затрагивающие как нуклеотидные остатки изучаемого сегмента РТ (A2058, A2059, C2063, G2061, A2062), так и некоторые нуклеотидные остатки, участвующие в функционировании ПТЦ рибосомы (U2585). Для изучения функциональных сигналов рРНК экспериментальными методами синтезированы трипептидные производные хлорамфеникола. Структуры производных хлорамфеникола были выбраны на основе виртуального скрининга комплексов всех трипептидных производных хлорамфеникола с 50S субъединицей рибосомы E. сoli. Для оптимизации структуры олигонуклеотидных ингибиторов взаимодействия TAR РНК и кTAR синтезированы производные олигонуклеотидного ингибитора взаимодействия TAR РНК и кTAR, содержащие на 3’-конце гидрофобные остатки холестерина или олеиновой кислоты. Для исследования транспорта этих производных в клетки на их 5’-конец присоединен флуорофор гексахлорфлуоресцеин. Соединение, содержащее остаток олеиновой кислоты, в клетки практически не проникало. Олигонуклеотид, конъюгированный с холестерином, в основном связывался с клеточными мембранами, однако часть его проникала в цитоплазму, где локализовалась в виде точечных структур, предположительно в эндосомальных пузырьках. Теломераза – фермент, удлиняющий концы линейных хромосом эукариот (теломеры). Теломеры защищают концы хромосом от потери генетической информации в результате укорочения в каждом раунде клеточного деления. Теломераза человека активна в половых, стволовых, эмбриональных клетках. По мере развития организма и дифференцировки клеток происходит инактивация этого фермента. Теломераза неактивна в соматических клетках, но в большинстве раковых клеток активность фермента восстанавливается. Два основных компонента: теломеразная РНК и теломеразная обратная транскриптаза – входят в состав активного холофермента. Экспрессия теломеразной обратной транскриптазы тонко регулируется на разных этапах жизни клеток. Теломеразная РНК экспрессируется постоянно, она очень стабильна и находится практически во всех клетках человеческого организма. Первоначально теломеразная РНК была открыта как некодирующая РНК. Она содержит матрицу для синтеза теломер, а также является структурным каркасом для фермента. Анализ первичной структуры теломеразной РНК позволил предположить кодирующий потенциал этой РНК. Мы выявили открытую рамку считывания, входящую в состав первичного транскрипта гена теломеразной РНК. На данном этапе в рамках выполнения работ по проекту, используя масс-спектрометрический подход, мы получили прямые доказательства наличия эндогенного белка hTERP в клетках человека. Одно из направлений проекта – исследование функций теломеразной РНК (TER), альтернативных функциям матрицы для синтеза теломерных повторов и платформы для сборки теломеразного комплекса. В 2013 году на кафедре химии природных соединений на модельном организме было показано, что TER может участвовать в процессе ограничения длины теломер. Это новая функциональная особенность теломеразной РНК и первый случай, когда система ограничения длины теломер закодирована непосредственно в теломеразной РНК. Мы предположили возможный контроль этого процесса особой структурой в теломеразной РНК. Для доказательства этого необходимо было разработать эффективный метод тестирования процесса, не основанный на глубоком секвенировании. Такой метод был разработан и опробован, что, возможно, позволит на следующем этапе проверить предположительные дополнительные детерминанты этого процесса в структуре теломеразной РНК модельного организма, оценить возможность их поиска в теломеразной РНК человека и спланировать способы влияния на этот процесс. Искусственное восстановление любой системы ограничения длины теломер – это возможность ограничить количество делений опухолевой клетки с активной теломеразой. Ранее на модельном организме D. rerio нами было показано, что некоторые внутренние участки генома, которые ограничены инвертированными теломерными повторами, транскрипционно активны. Так была выявлена новая длинная некодирующая РНК TREPRA (Telomere Repeat RNA), которая транскрибируется с участка генома, ограниченного внутренними теломерными повторами, ассоциированными с повторяющимися элементами генома. На культуре фибробластов этого организма нами было показано, что TREPRA образует специфические кластерные структуры в ядрах, морфология которых изменяется в стареющих фибробластах. На данном этапе проекта похожие РНК-зависимые структуры, в формировании которых принимает участие TREPRA, были выявлены также на срезах эмбрионов D. rerio. Таким образом, впервые было показано наличие подобных РНК-кластеров не только в культуре клеток, но и в организме D. rerio. Этот факт делает осмысленным экспериментальный поиск гомологов этой РНК у человека. | ||
2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Изучение функционирования нескольких типов некодирующих РНК: бактериальных, вирусных и эукариотических с целью выявления новых мишеней для направленного действия терапевтических средств нового поколения. |
Результаты этапа: Отсутствие тирозиновой или аргининовой TRAR не приводит к значительным различиям в скорости роста клеток (в бедной или богатой среде) и не влияет на их способность выживать при разнообразных стрессах (кислотном, щелочном, окислительном, холодовом и тепловом), а повышает склонность клеток к агрегации. Отсутствие 6S РНК в клетках R. sphaeroides не влияет на характер их роста в различных условиях: микроаэробных, аэробных, анаэробных и фототрофных, и на выживаемость клеток в условиях окислительного стресса. Прямая зависимость уровня экспрессии 6S РНК от степени аэрации культур или фотосинтетической активности клеток не выявлена. Однако показано, что уровень синтеза 6S РНК в клетке существенно различается при выращивании культур в анаэробных условиях и при выращивании их в фототрофных, микроэробных или аэробных условиях. Впервые в условиях in vivo и in vitro продемонстрирован синтез пРНК R. sphaeroides. Установлено, что делеция гена 6S РНК приводит к изменению уровня экспрессии различных белков R. sphaeroides. 6S РНК из B. japonicum аккумулируется в поздней стационарной фазе. Профиль экспрессии этой 6S РНК аналогичен профилю экспрессии 6S РНК E. coli. Повышение уровня экспрессии 6S РНК в 1,5 раза не влияет на рост клеток B. japonicum в ранней экспоненциальной фазе. С целью выяснения природы аллостерических взаимодействий между различными функциональными центрами рибосомы, лежащих в основе процессов регуляции трансляции, а также механизма работы антибиотиков, воздействующих на рибосомный туннель (РТ), были проведены молекулярно-динамические (МД) исследования комплексов рибосомы со стоп- пептидами. С помощью подхода виртуальной эволюции низкомолекулярных лигандов осуществлен поиск гексапептидов, обладающих высоким сродством к рибосоме. Экспериментальными методами изучены комплексы трипептидных производных хлорамфеникола с бактериальными рибосомами. МД исследования были направлены на детальный анализ конформационной подвижности сегмента стенки туннеля рибосомы E. coli, образованного участком 2058-2063 полинуклеотидной цепи 23S рРНК, а также примыкающим к нему в третичной структуре рибосомы модифицированным нуклеотидным остатком m2A2503, и характера взаимодействия C-концевого участка стоп-пептида SecM с данным участком полинуклеотидной цепи 23S рРНК. Этот сегмент макромолекулы 23S рРНК рассматривается в литературных источниках как один из наиболее вероятных участников процесса передачи функциональных сигналов из внутренних районов РТ в ПТЦ рибосомы. Результатом проведенных виртуальных эволюций явились две пептидные последовательности, для которых предсказано прочное связывание с рибосомным туннелем, в котором произошел обнаруженный нами ранее каскад конформационных превращений образующих его стенки нуклеотидных остатков, возможно, связанный с остановкой трансляции. По вытеснению флуоресцентного производного эритромицина изучены комплексы трипептидных производных хлорамфеникола с рибосомами E. coli, структуры которых были выбраны на основе виртуального скрининга комплексов всех трипептидных производных хлорамфеникола с 50S субъединицей рибосомы E.сoli, оценена роль гидрофобных и заряженных боковых радикалов аминокислотных остатков во взаимодействии пептидов с элементами рибосомного туннеля. Изучена способность липопептидов и положительно заряженных полимеров улучшать проникновение в клетки олигонуклетидного ингибитора взаимодействия TAR РНК и кTAR 11-OMHex. Установлено, что наибольшую эффективность доставки олигонуклеотида в клетки HEK 293T обеспечивали липопептид St-RXR4 (St-RXRRXRRXRRXR) и аргинин-содержащий полимер на основе сополимера метоксиполиэтиленгликоля и полилизина (MPEG2-gPLL). В клетках олигонуклеотид был локализован как в цитоплазме, так и в ядре, для комплекса 11-OM-Hex с липопептидом St-RXR4 также наблюдалось мозаичное распределение флуоресценции олигонуклеотида, характерное для включения в эндосомы (Рис. I). Получено два препарата рекомбинантных белков GST-HMGA1 и HMGA1-6xHis и проверена их ДНК- и РНК-связывающая активность. Установлено, что оба белка способны связывать ДНК, но только белок HMGA1-6xHis эффективно связывается с участком шпильки L2 в 7SK РНК и TAR РНК. Рекомбинантный препарат гетеродимерного белка человека Ku получен с использованием вектора для ко-экспрессии в клетках E. coli белков Ku70 и Кu80 с одной бицистронной мРНК с внутренним сайтом посадки рибосом. Установлено, что полученный гетеродимер Ku связывается с L2 петлей 7SK РНК, TAR РНК и TAR, содержащей мутацию C37 > T, препятствующую связыванию TAR с белком Tat ВИЧ-1, с большим сродством, чем HMGA1-6xHis. Впервые обнаружено, что гетеродимер Ku способен образовывать с TAR РНК два типа комплексов (Рис. II). Сравнение значений Kd комплексов TAR с белками Ku и HMGA1 позволяет сделать заключение о возможности вытеснения HMGA1 из комплекса с TAR гетеродимером Ku. Результатом варьирования уровня экспрессии гена теломеразной РНК человека в клетках НЕК 293 является изменение протеомы клеток, не влияющее на продолжительность клеточного цикла, а также изменение фенотипа (форма и размер клеток, ядра, цитоскелета). Структура ограничивающего элемента теломеразной РНК H. polymorpha важна для функционирования системы контроля длины теломер. Одновременные мутации матричного участка и структуры ограничивающего элемента нарушают функциональность теломеразной РНК. Содержание в клетках человека РНК, гомологичной TREPRA D. rerio, чрезвычайно низко (единичные молекулы). Этого количества недостаточно для формирования кластерных структур в ядрах клеток человека. Установлено, что ТЕRRA РНК использует альтернативный сайт взаимодействия с теломеразой и, по-видимому, участвует в регуляции удлинения теломер теломеразой. | ||
3 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Некодирующие РНК: изучение механизмов функционирования и поиск потенциальных мишеней для терапии |
Результаты этапа: Масштаб уровня регуляции транскрипции с помощью РНК не уступает известному нам миру белков-регуляторов, а по изученности неизмеримо от него отстает. В геноме E. coli встречаются необычные повторяющиеся элементы, закодированные в оперонах тРНК, и содержащие 18-19 нуклеотидов с 3’-конца той тРНК, в опероне которой они расположены, эти элементы были названы TRAR. В ходе выполнения проекта было показано существование этих элементов в виде молекул РНК, специфический процессинг 5’- и 3’- концов, возможность комплексобразования со своей тРНК in vitro и in vivo. Биоинформатический анализ бактериальных геномов показал, что подобные элементы распространены среди самых разнообразных видов бактерий и встречаются в оперонах любых тРНК. На примере E. coli, с использование инструментов редактирования генома, удалось создать штаммы отличающиеся наличием определенных TRAR элементов. Фенотипический анализ выявил рад различий, самое существенное связано с повышенной агрегацией клеток, в которых был удален TRAR элемент, дальнейшие исследования показали, что этот эффект вызван повышенной экспрессии гена agn43. 6S РНК – уникальная молекула, которая способна связывать РНК-полимеразу и ингибировать транскрипцию. В 2014-2016 гг. были подробно изучены свойства и функции 6S РНК из бактерий Bacillus subtilis, Rhodobacter sphaeroides, Bradyrhizobium japonicum и Escherichia coli. B. subtilis интересна существованием дополнительной 6S РНК (6S-2 РНК), которая в отличие от 6S-1 РНК и 6S-РНК Е. coli синтезируется не в стационарной фазе роста клеток, а, наоборот, в условиях их активного роста и деления. Впервые определены профили экспрессии 6S РНК в альфа-протеобактериях: 6S РНК B. japonicum аккумулируется в поздней стационарной фазе роста клеток (аналогично 6S РНК E. coli), в то время как единственная 6S РНК R. sphaeroides имеет схожий профиль экспрессии с 6S-2 РНК B. subtilis. Очевидно, функции этих 6S РНК должны отличаться от 6S РНК E. coli. Нами идентифицировано 35 белков, экспрессия которых в клетке возрастает в отсутствие 6S-1 и/или 6S-2 РНК B. subtilis. Их функции связаны с процессами метаболизма в условиях окислительного стресса, аминокислотного голодания и холодового шока. В обычных условиях 6S РНК ингибируют синтез этих белков. Впервые установлены фенотипические изменения клеток R. sphaeroides с делецией гена 6S РНК, выражающиеся в замедлении скорости их роста по сравнению с клетками дикого типа в среде с высоким содержанием соли. Для клеток E. coli с делецией гена 6S РНК зафиксирован аналогичный «перекисный» фенотип в присутствии перекиси водорода или трет-бутилгидропероксида. Согласно данным протеомного анализа 6S РНК активирует экспрессию алкилгидропероксидредуктазы AhpC, одного из основных ферментов, катализирующих деградацию пероксидных соединений в клетке. Очевидно клетки с 6S РНК легче переносят окислительный стресс. С целью выяснения природы аллостерических взаимодействий между различными функциональными центрами рибосомы, лежащих в основе процессов регуляции трансляции, а также механизма работы антибиотиков, воздействующих на рибосомный туннель (РТ), были проведены молекулярно-динамические (МД) исследования рибосомы, а также экспериментальными методами изучены пептидные производные хлорамфеникола, в которых антибиотик связывается с А-сайтом пептидилтрансферазного центра, а пептидный остаток направлен в РТ в район сенсорных нуклеотидов. МД исследования были направлены на детальный анализ конформационной подвижности сегмента стенки туннеля рибосомы E. coli, образованного участком 2058-2063 полинуклеотидной цепи 23S рРНК, а также примыкающим к нему в третичной структуре рибосомы модифицированным нуклеотидным остатком m2A2503, и характера взаимодействия C-концевого участка стоп-пептида SecM с данным нуклеотидным остатком. Получен набор конструкций для прокариотической экспрессии белков HMGA1, Ku70, Кu80 и гетеродимера Ku70/Ku80. В результате оптимизации условий экспрессии белков в клетках E. coli и их выделения удалось получить HMGA1, Ku70 и гетеродимер Ku70/Ku80. Факт получения именно этих белков был подтвержден методом масс-спектрометрии, а для Ku70 и гетеродимера Ku70/Ku80 еще и Вестерн-блотом с использованием антител к каждой из субъединиц. Исследовано взаимодействие полученных белков с разными структурами РНК. Установлено, что HMGA1 связывает шпильку L2 в 7SK РНК, TAR РНК и TAR РНК, содержащей замену C37T, препятствующую связыванию TAR с вирусным белком Tat, с константами диссоциации (Kd) 350, 320, 400 нМ, соответственно. Белок Ku70 связывает TAR РНК с Kd=40 нМ. Исследование связывания гетеродимера Ku с несколькими РНК-шпильками разной структуры, а также одноцепочечной и двуцепочечной РНК показало, что структура шпильки практически не влияет на эффективность взаимодействия РНК с Ku: Kd для комплексов Ku со всеми РНК-шпильками составили 1-7 нМ, для одноцепочечной РНК и РНК-дуплекса – 20 нМ. Сравнение значений Kd комплексов TAR РНК с Ku и HMGA1 позволяет сделать заключение о возможности вытеснения HMGA1 из комплекса с TAR гетеродимером Ku. Результатом исследований, проводимых при поддержке РНФ, были открыты не известные ранее функции некодирующих РНК, показана их роль в функционировании клетки и выявлены особенности их комплексов с белками. Это позволяет предположить, что будущие технологии разработки лекарственных препаратов для терапии социально-значимых заболеваний будут направлены на регуляцию активности именно нкРНК, вовлеченных в различные внутриклеточные процессы. | ||
4 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Некодирующие РНК: изучение механизмов функционирования и поиск потенциальных мишеней для терапии |
Результаты этапа: Исследования, проводимые на данном этапе проекта, позволили расширить спектр функций, которые выполняют некодирующие РНК, что дает возможность пересмотреть существующие представления об их роли в регуляции состояния клетки и ее ответа на внешние и внутренние воздействия. Проведен биоинформатический и экспериментальный анализ генов возможных партнеров для тРНК-ассоциированных РНК (TRAR РНК). Биоинформатический анализ большого набора геномов указывает на отсутствие у TRAR-элементов достоверной ассоциации с каким-либо белок-кодирующим геном. Экспериментальный анализ возможных партнеров на примере бактерии E. coli также не выявил белков, взаимодействующих с TRAR. В ходе работы проведён компьютерный и экспериментальный анализ вторичной структуры TRAR-элементов. С использованием метода химической модификации показана структурированность 5’-конца тирозинового TRAR, в то время как 3’-конец слабо структурирован. Обнаруженные элементы вторичной структуры могут иметь важное значение для обеспечения функциональной роли TRAR-элементов. Несмотря на достигнутые нами результаты в изучении функционирования нескольких важных типов малых РНК многообразие механизмов функционирования генома требует расширения этих исследований. В частности, совсем недавно появились сведения о существовании малых РНК, которые, возможно, в определенных условиях могут становиться кодирующими и являться матрицей для синтеза коротких пептидов. В рамках продолжения нашей работы мы выбрали именно такой совершенно новый и перспективный объект – малые РНК из бактерии Sinorhizobium meliloti. Впервые в клетках S. meliloti детектированы новые малые РНК RreS1–RreS4. Получены генетические конструкции, позволяющие проверить возможность трансляции RreS1–RreS4 РНК. Сконструированы плазмиды, обеспечивающие суперэкспрессию RreS1–RreS4 РНК и пептидов, закодированных в этих РНК. Впервые установлено, что эффективность синтеза 6S РНК S. meliloti практически не меняется в разных фазах клеточного роста. Методами молекулярно–динамического моделирования с одной стороны получена наиболее вероятная структура комплекса хлорамфеникола с бактериальной рибосомой, находящейся в A,A/P,P–состоянии. Предлагаемая структура комплекса позволяет объяснить результаты биохимических исследований взаимодействия хлорамфеникола с бактериальными рибосомами. С другой - исследован обнаруженный ранее конформационный переход в районе сенсорных нуклеотидных остатков 2058-2585 на целой бактериальной рибосоме в комплексе с аминоацил-тРНК в А- и Р-сайтах, либо с аминоацил-тРНК в Р- и т-РНК в Е-сайтах. Найдены согласованные конформационные изменения нуклеотидных остатков рРНК, которые могут быть вовлечены в аллостерический путь передачи сигналов из сенсорных районов рибосомного туннеля в пептидилтрансферазный центр рибосомы. Осуществлен синтез серии фрагментов пролин-богатых пептидов и проведена их конъюгация с десмикозином либо хлорамфениколамином для последующего изучения взаимодействия аминокислотных остатков с сенсорными нуклеотидными остатками бактериальных рибосом. Исследованы комплексы рибосом E. coli c ранее полученными трипептидными аналогами хлорамфеникола, для которых методом виртуального скрининга было предсказано высокое сродство к бактериальным рибосомам. Методом молекулярного пробинга показано, что трипептидные аналоги связываются с рибосомами наподобие хлорамфеникола. Методом, основанным на вытеснении флуоресцентно-меченного лиганда рибосомы, показано, что предсказанное расчетными данными сродство к рибосоме коррелирует с экспериментально полученными константами диссоциации комплексов, для аналога, обладающего наибольшим связыванием, сродство к рибосоме E. coli в 30 раз превышает сродство хлорамфеникола. Малая некодирующая РНК - TAR (trans-activation response) РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) играет важнейшую роль в процессе транскрипции с вирусного промотора после интеграции ДНК ВИЧ-1 в геном. Предполагается, что активация транскрипции интегрированного провируса при переходе из латентной в литическую фазу инфекции также обусловлена взаимодействием TAR РНК с какими-то клеточными белками. Для понимания механизма выхода вируса из латентной фазы необходимо точно идентифицировать белки, взаимодействующие с TAR РНК. Методом соосаждения с 3'-биотинилированной TAR РНК белков из ядерных лизатов клеток HEK 293T и Jurkat с последующей масс-спектрометрией впервые установлено взаимодействие между TAR-РНК и белками SFPQ и NONO. Это взаимодействие не разрушается при обработке клеток двумя разными активаторами транскрипции: TNF-α и эноксацином. Этот факт указывает на то, что при активации транскрипции не происходит вытеснения SFPQ и NONO из их комплекса с TAR-РНК другими клеточными белками. Методом УФ-кросс-линкинга в ядерных лизатах клеток HEK 293T идентифицировано прямое связывание белка NONO с TAR РНК. Это подтверждает непосредственное взаимодействие данного белка с TAR РНК в составе комплекса TAR РНК/SFPQ/NONO. Сконструированы системы для изменения (понижения/повышения) уровня исследуемых белков в клетке. Подобрана siRNA к SFPQ, вызывающая 50% снижение его уровня, и получена линия HEK 293T с нокаутом гена sfpq, в которой количество белка SFPQ снижено на 80% по сравнению с исходной линией. Получены вектора эукариотической экспрессии белков SFPQ и NONO с аффинными метками myc- и HA-, соответственно. С помощью иммуноблоттинга с антителами на с-Myc и на HA показано, что в клетках НЕК 293Т с этих векторов идет экспрессия обоих белков. Теломераза – фермент, поддерживающий длину теломер, специальных ДНК-белковых структур на концах линейных хромосом эукариот. Теломераза обеспечивает пролиферативный потенциал большинства раковых клеток, поэтому рассматривается как универсальная мишень для терапии онкологических заболеваний. Парилирование белков имеет важное значение в регуляции репарации ДНК, т.е. поддержании целостности генома. Высокий пролиферативный потенциал раковых клеток требует активации процессов репарации, поэтому ингибиторы, влияющие на компоненты клетки, регулирующие статус парилирования, рассматриваются как потенциальные антираковые препараты. Галлотанин – ингибитор поли(АДФ)-гликогидролазы, обладает широким спектром действия. Было продемонстрировано, что галлотанин ингибирует активность теломеразы. Ингибирование теломеразы в клетке может происходить в результате прямого взаимодействия вещества с ферментом, из-за сниженного количества компонентов теломеразы в клетке, а также нарушений в процессе биогенеза (сборки) активного фермента. Обработка клеток галлотанином не вызывает изменения количества компонентов теломеразы, не влияет на эффективность сборки фермента, но ингибирует теломеразу как in vivo, так и in vitro. Полученные данные свидетельствуют о том, что галлотанин ингибирует теломеразу в результате прямого связывания с ферментом. Полученные результаты позволят предположить, что будущие технологии разработки лекарственных препаратов для терапии социально-значимых заболеваний (бактериальные и вирусные инфекции, онкологические заболевания) будут направлены на регуляцию активности именно нкРНК, вовлеченных в различные внутриклеточные процессы. | ||
5 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Некодирующие РНК: изучение механизмов функционирования и поиск потенциальных мишеней для терапии |
Результаты этапа: Проведен анализ распределения TRAR элементов среди близкородственных штаммов E. coli, а также других представителей энтеробактерий. Показано, что у близкородственных с эволюционной точки зрения штаммов наблюдаются значительные различия в наличии и структуре TRAR элементов. Это говорит о том, что вероятный механизм распространения этих элементов – это горизонтальный перенос генов. Можно предположить, что, во-первых, появление TRAR элементов должно давать какое-то преимущество, а, во-вторых, эти элементы должны обладать способностью к горизонтальному переносу. При помощи анализа транскриптомных данных показано, что TRAR элементы экспрессируются, а их количество может меняться в зависимости от условий, например, окислительный стресс приводит к повышению количества TRAR РНК. В последнее время широкое применение в различных областях биотехнологии и для редактирования генома получили никующие эндонуклеазы, которые избирательно гидролизуют только одну цепь в двутяжевой ДНК. Мы предложили олигонуклеотидные ингибиторы такого фермента - Nt.BspD6I, содержащие остатки азобензола или триэтиленгликоля и разрывы в цепи ДНК. Эти соединения позволяют модулировать каталитическую активность Nt.BspD6I под действием температуры. Предложенный подход может послужить основой для создания ферментов с заданными свойствами. Синтезирован пептид RreB, потенциальный продукт трансляции Rre РНК B. japonicum. Показано, что он способен вытеснять флуоресцентно меченный эритромицин из рибосомного туннеля и в больших концентрациях (10 мМ) выступать токсином, подавляющим синтез репортерного белка. В условиях окислительного стресса, вызванного присутствием в среде экзогенного пероксида водорода 6S РНК E. coli активирует регуляцию экспрессии транскрипционного фактора SoxS и трёх белков AhpC, SodA, YaaA – участников ответа клетки на окислительный стресс, что может обуславливать устойчивость клеток дикого типа к пероксиду водорода. Системы рестрикции-модификации обеспечивают устойчивую защиту бактериальной клетки от вирусной атаки. ДНК-метилтрансфераза SsoII (M.SsoII) из патогенной бактерии Shigellasonnei ингибирует транскрипцию своего собственного гена за счет связывания с регуляторным участком в промоторной области РНК-полимеразы, расположенной между генами системы рестрикции-модификации, в дополнение к своей основной функции – метилированию ДНК. Мы показали, что несмотря на предпочтительное взаимодействие M.SsoII с регуляторным участком фермент преимущественно метилирует ДНК благодаря наличию в клетке кофактора S-аденозил-L-метионина, который повышает скорость образования каталитически компетентных комплексов этого белка с многочисленными участками метилирования в геномной ДНК клетки-хозяина. Существование системы Р–М SsoII in vivo практически не представляет опасности для клетки-хозяина после того, как было проведено полное метилирование клеточной ДНК. В последнее время широкое применение в различных областях биотехнологии и для редактирования генома получили никующие эндонуклеазы, которые избирательно гидролизуют только одну цепь в двутяжевой ДНК. Мы предложили олигонуклеотидные ингибиторы такого фермента - Nt.BspD6I, содержащие остатки азобензола или триэтиленгликоля и разрывы в цепи ДНК. Эти соединения позволяют модулировать каталитическую активность Nt.BspD6I под действием температуры. Предложенный подход может послужить основой для создания ферментов с заданными свойствами. Методами молекулярной динамики проведено моделирование структуры рибосомы на разных этапах элонгации трансляции. Проведен сравнительный анализ комплексов рибосомы с тРНК, связанными с ее каноническими и гибридными сайтами, проведено сравнение рибосом дикого типа и рибосом, несущих мутации, ингибирующие связывание тРНК в А-, Р- и Е-сайтах. Найдены согласованные конформационные изменения нуклеотидных остатков рРНК как в 30S, так и 50S-субчастицах, которые могут быть вовлечены в пути передачи сигналов от сенсорных районов рибосомы в ПТЦ, в том числе, аллостерические. Осуществлена количественная оценка комплексообразования синтезированных производных макролидных антибиотиков, содержащих в структуре фрагменты пролин-богатых антимикробных пептидов (онкоцина, бактенецина), с рибосомой E. coli с помощью метода конкурентного вытеснения флуоресцентного производного эритромицина, специфически связывающегося в рибосомном туннеле. Определены константы диссоциации комплексов. Показано, что синтезированные производные макролидов способны ингибировать синтез белка, воздействуя на трансляцию, в двойной репортерной системе pDualrep2. Исследованы комплексы рибосом E.coli c ранее полученными трипептидными аналогами хлорамфеникола, для которых методом виртуального скрининга было предсказано высокое сродство к бактериальным рибосомам. Показано, что трипептидные аналоги хлорамфеникола успешно ингибируют биосинтеза белка DHFR в бесклеточной системе. Сконструированы векторы для прокариотической экспрессии белков SFPQ и NONO, содержащих аффинные метки. Получен рекомбинантный белок SFPQ. Исследовано влияние белка SFPQ на уровень экспрессии с репортерной конструкции, содержащей ген люциферазы, находящийся под контролем LTR ВИЧ-1. Получена конструкция с "вырезанной" из последовательности LTR последовательностью TAR РНК. Проверено влияние уровня SFPQ на уровень экспрессии с этой репортерной конструкции. Установлено, что влияние уровня белка SFPQ на уровень транскрипции с промотора LTR ВИЧ-1 обусловлено их взаимодействием с TAR РНК. Таким образом, впервые показано, что белок SFPQ может рассматриваться в качестве регулятора транскрипции с промотора ВИЧ-1. Дальнейшие исследования помогут выяснить механизм этой регуляции и определить возможность управления транскрипции путем воздействия на комплекс SFPQ с TAR РНК. Установлено, что снижение экспрессии PARP1 приводит к стабилизации теломеразного комплекса. Взаимодействие теломеразной РНК с дискерином значительно усиливается при снижении экспрессии PARP1. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".