ИСТИНА

Строение и функции рибосомных РНК (рРНК), составляющих более 80% всей клеточной РНК, изучаются уже не одно десятилетие, однако молекулярные механизмы их работы в рибосоме не известны. Рибосома обладает несколькими функциональными центрами, построенными преимущественно или исключительно из сегментов рРНК. Работа этих центров строго скоординирована, что достигается, как это выяснилось в последние годы, путем передачи сигналов от одного центра к другому. Поскольку расстояние между функциональными центрами рибосомы существенно превышает их размеры, можно предположить, что передача функциональных сигналов в ходе трансляции генетической информации осуществляется аллостерически путем направленных локальных изменений в структуре рРНК. В результате выполнения проекта предполагается выяснить механизм участия рРНК в такой передаче сигнала. Еще один объект настоящего исследования – теломеразная РНК, которая необходима организму для поддержания целостности хромосом. Планируется определить, существует ли у теломеразной РНК какая-либо еще функция помимо основной. Необходимым этапом является также выяснение особенностей функционирования только что открытой нкРНК D. rerio, названной TREPRA (Telomere Repeat RNA), которая закодирована в областях генома, окруженными инвертированными теломерными повторами. Расположенный на обоих концах геномной РНК ВИЧ-1 TAR (trans-activation response) элемент участвует во многих процессах репродукции вируса. Из всего множества функций TAR РНК в проекте предполагается исследовать роль TAR РНК в процессе активации транскрипции интегрированного вирусного генома в латентной фазе, а также оптимизировать структуру и метод внутриклеточной доставки ранее сконструированного ингибитора взаимодействия TAR РНК с ее ДНК-копией на начальном этапе обратной транскрипции. В проекте также запланировано исследование двух малоизученных бактериальных нкРНК - TRAR (tRNA-associated RNA) и 6S РНК с целью выяснения функциональной роли этих загадочных молекул. Скорее всего, роль TRAR связана с функционированием тРНК, поскольку гены TRAR всегда следуют за генами тРНК. Для изучения свойств и функций 6S РНК будут выделены новые 6S РНК из различных бактерий, в том числе из патогенной L. monocytogenes.

Regulation of intracellular processes by non-coding RNAs (ncRNAs) is a vast and insufficiently explored field of molecular and cell biology. Recently, the number of publications in high-rating journals devoted to the ncRNA structure and biological role has demonstrated an explosive growth testifying a huge interest to this field. Next generation sequencing techniques allowed for identifying an extraordinary diversity of RNA transcripts which do not code for proteins. Studying ncRNA functional role may lead to a discovery of fundamentally new molecular mechanisms of living systems functioning. In the present project, we propose studying a set of ncRNAs with established functions (ribosomal RNA, telomerase RNA and TAR RNA of human immunodeficiency virus (HIV-1)) as well as with unknown functions (bacterial ncRNAs TRAR and 6S, RNA TREPRA from Danio rerio) using several new methodological approaches. Structure and function of ribosomal RNAs (rRNAs) which constitute more that 80% of all cellular RNA have been under investigation for several decades; however, the molecular mechanisms of their functioning remain unknown. Ribosome has several functional centers built predominantly or purely of rRNA segments. Functioning of these centers is strictly coordinated; this is attained by a signal transmission from one center to another, as has been found during the last years. Since the distance between the ribosome functional centers is significantly larger than their dimensions, one could suppose that the functional signals transmisson during translation is performed allosterically via directed local changes in rRNA structure. As a result of the project, we propose to clarify the mechanism of rRNA participation in such signal transmission. The second object of the present study is telomerase RNA which is necessary for the organism for maintaining chromosome ends integrity. We propose to find if the telomerase RNA has another function in addition to the main one. The necessary step is to clarify functioning peculiarities of a ncRNA just found in D. rerio and named TREPRA (Telomere Repeat RNA). TREPRA is encoded in the genome regions, surrounded by inverted telomeric repeats. The TAR (trans-activation response) element which is situated on both ends of HIV-1 genomic RNA participates in many processes of the virus reproduction. Out of numerous TAR functions, we propose to investigate the TAR role in the activation of the integrated viral genome transcription during the latent phase. We also plan to optimize the structure and the method of intracellular delivery of the previously constructed inhibitor which prevents TAR binding to its DNA copy during the initial step of the reverse transcription. A study of two insufficiently explored bacterial RNAs is proposed in this project, namely TRAR (tRNA-associated RNA) and 6S RNA. The purpose is to clarify functional roles of these enigmatic molecules. Most likely, the TRAR role is connected with tRNA functioning, since it is encoded by genes which always follow the tRNA genes. The properties and functions of new 6S RNA from different bacteria (including the pathogenic L. monocytogenes) will be studied.

В рамках изучения функциональной роли нкРНК выбраны несколько конкретных молекул с совершенно разными функциями. Реализация проекта может привести как к открытию новых механизмов регуляции в живых системах, так и найти новые мишени для терапии. В проекте будет определена функциональная роль ранее не изученных малых нкРНК (TRAR и 6S) в бактериальных клетках. Можно ожидать, что TRAR РНК физически и/или функционально взаимодействуют с тРНК. Такое взаимодействие будет первым примером регуляции активности тРНК с помощью нкРНК. В рамках проекта впервые будет установлена функция других бактериальных нкРНК – 6S РНК из L. monocytogenes, B. japonicum и R. sphaeroides. Есть основания предполагать, что в перечисленных бактериях 6S РНК является ингибитором РНК- полимеразы и таким образом регулирует экспрессию некоторых генов. Планируется оценить значение 6S РНК для вирулентности L. monocytogenes и дифференцировать роли 6S-1 и 6S-2 РНК из B. subtilis. Будет изучен механизм участия рРНК в обмене сигналами между функциональными центрами рибосомы с использованием полученных в последние годы структур высокого разрешения как самой рибосомы, так и ее комплексов с лигандами, участвующими в биосинтезе белка, и антибиотиками, его ингибирующими. Любые новые данные об участии бактериальных нкРНК в регуляции клеточных процессов представляют огромный интерес для медицины, поскольку эти РНК могут служить потенциальными мишенями для новых антибактериальных препаратов. Новые представления относительно TAR РНК ВИЧ-1 позволят разрабатывать ранее неизвестные подходы для антиретровирусной терапии. Будет исследована роль TAR и ее клеточных партнеров в активации экспрессии «спящего» интегрированного генома ВИЧ-1 (в латентной фазе). Взаимодействие TAR РНК с ее ДНК-копией необходимо для успешного синтеза ДНК-копии геномной РНК вируса; его ингибирование подавляет весь процесс репликации ВИЧ-1. Будет оптимизирована структура ранее сконструированного ингибитора взаимодействия TAR РНК с ее ДНК-копией, а также метод его доставки в клетку. Важным является ответ на вопрос – обоснованно ли теломеразная РНК отнесена к нкРНК, поскольку есть веские основания ожидать наличия у нее альтернативной функции. Будут получены данные, которые позволят уточнить механизм участия непосредственно теломеразной РНК в системе ограничения длины теломер. Будет проведен анализ, позволяющий подтвердить уникальность только что найденной нкРНК D. rerio TREPRA и предполагаемый механизм ее действия. По предварительным данным эта РНК участвует в образовании специфических структур, регулирующих структурную организацию хроматина, в ядрах отдельных типов клеток. Мы предполагаем, что эта РНК участвует в регуляции тканеспецифической экспрессии областей генома. Новые представления об альтернативных функциях теломеразной РНК и механизме ее регуляции, а также понимание механизмов тканеспецифической регуляции экспрессии генов позволят разработать новые и скорректировать существующие подходы при выборе мишеней антираковой терапии.

На кафедре были впервые разработаны широко применяемые сейчас в мире методы направленного расщепления РНК с помощью РНКазы Н, оригинальные методы ковалентного связывания РНК с белками. Все эти методы успешно применялись в ходе изучения функциональной топографии отдельных элементов рибосомной РНК в рибосоме. У коллектива исполнителей есть достаточный опыт работы в области функциональной геномики бактерий. Нашим коллективом была установлена неизвестная ранее функция 6 генов E. сoli. В рамках исследования свойств и функций 6S РНК в клетках B. subtilis участниками проекта впервые была экспериментально подтверждена способность 6S-1 и 6S-2 РНК ингибировать транскрипцию генов и влиять на уровень экспрессии различных белков. Таким образом, была подтверждена теоретическая модель функционирования 6S РНК в клетке. Коллектив обладает значительным опытом в области синтеза аминокислотных и пептидных аналогов рибосомных антибиотиков и изучения их комплексов с бактериальными рибосомами, а также опытом молекулярно-динамических расчетов комплексов макролидов с различными бактериальными рибосомами. Участники проекта в течение ряда лет разрабатывают методы автоматического синтеза модифицированных фрагментов ДНК и РНК, их использования для получения конъюгатов различной структуры, а также аффинной модификации белков. Эти соединения зарекомендовали себя как уникальные инструменты исследования белково-нуклеиновых взаимодействий и модуляторы активности НК-связывающих белков. Установлено, что короткие олигонуклеотиды, содержащие галогенированные производные флуоресцеина, ингибируют активность двух ферментов ВИЧ-1, интегразы и обратной транскриптазы. Имеется опыт работы с клетками высших эукариот, необходимый для изучения альтернативных функций TER. Отработаны классические методы оценки эффективности работы теломеразы по длине теломер, методы геномных манипуляций для термотолерантных дрожжей

В ходе выполнения проекта было показано существование нового класса РНК – TRAR РНК, гены этих РНК располагаются после генов тРНК и содержат последние 18-19 нуклеотидов расположенной перед ними тРНК. Экспрессия TRAR РНК трех различных оперонов tyrTV, serX и lysT-Q была проанализирована при помощи метода количественного ПЦР. TRAR РНК оперона lysT-Q присутствуют в клетках в концентрации, сравнимой с концентрацией соответствующей тРНК, концентрация tyr TRAR в десять раз меньше концентрации соответствующей тРНК, при этом ser TRAR не удалось детектировать. Для tyr и lys TRAR были определены 5'- и 3'-концы РНК. 5'-Конец TRAR РНК образуется в результате 3'-процессинга расположенной перед ним тРНК, 3'-конец TRAR РНК в большинстве случаев - CCA, такой же как и у тРНК. Также нам удалось показать, что процессинг 3'-конца TRAR РНК происходит независимо от процессинга тРНК. Был проведен биоинформатический поиск TRAR РНК среди небольшого набора энтеробактерий. Среди одиннадцати различных штаммов только tyr TRAR РНК была найдена во всех организмах, другие TRAR могут быть найдены в половине анализируемых организмов. Последовательность TRAR очень консервативна (не менее, чем тРНК), и в конкретном организме TRAR больше похожи друг на друга, чем соответствующие тРНК. Моделирование вторичной структуры позволило найти консервативные мотивы во всех TRAR РНК. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции является одним из важнейших механизмов в клетках прокариот. Оказалось, что малые некодирующих РНК, так называемые 6S РНК, способны ингибировать транскрипцию за счет непосредственного связывания с холоферментом РНК-полимеразы и блокирования её активного центра. Кроме E. coli наличие гена 6S РНК предполагается более чем в 130-ти видах бактерий, но только для 16-ти из них этот факт подтвержден экспериментально. Немногочисленные данные, известные для 6S РНК из этих бактериальных систем, свидетельствуют о возможном отличии свойств и функций их 6S РНК от 6S РНК E. coli. Наиболее интересным фактом является существование двух различных 6S РНК (6S-1 и 6S-2) в грамположительной бактерии Bacillus subtilis. Причины «появления» дополнительной 6S-2 РНК в условиях активного роста и деления клеток, а также её свойства и функции неизвестны и будут детально исследованы. Аналоги 6S РНК были найдены и в клетках высших эукариот – Alu РНК человека и B2 РНК мыши. Общность функциональных свойств этих нкРНК позволяет использовать 6S РНК B. subtilis в качестве модели для понимания основ нкРНК-зависимых механизмов регуляции транскрипции. В рамках данного проекта впервые показано, что делеции генов bsrA и bsrB, кодирующих 6S-1 и 6S-2 РНК, влияют на экспрессию белков в клетках B. subtilis. Идентифицировано 35 белков, содержание которых в клетке возрастает в отсутствие 6S-1 и/или 6S-2 РНК. Установлено, что ингибирование экспрессии белков AroA, Mdh, CysK, MntA, YvyD, AhpC, YjcG, YgaF, YraA, RplJ, GreA и Tpx может быть вызвано влиянием как 6S-1, так и 6S 2 РНК. Повышение уровня экспрессии белков Pyk и PdhB наблюдалось только при делеции гена bsrA. Регуляция остальных идентифицированных белков осуществляется главным образом посредством 6S-2 РНК. Функции большинства выявленных белков связаны с процессами метаболизма в условиях окислительного стресса, аминокислотного голодания и холодового шока. Показано, что условия аэрации клеточной культуры влияют на скорость роста R. sphaeroides. Впервые показано, что профиль экспрессии 6S РНК R. sphaeroides отличается от 6S РНК E. coli. Максимальная концентрация 6S РНК R. sphaeroides приходится на стадию перехода из экспоненциальной в стационарную фазу роста клеток. В стационарной фазе уровень экспрессии 6S РНК R. sphaeroides заметно снижается. Таким образом, единственная 6S РНК R. sphaeroides имеет схожий профиль экспрессии с 6S-2 РНК B. subtilis. Среднее время жизни 6S РНК R. sphaeroides в клетке составляет более 4 ч, что косвенно указывает на формирование комплекса этой 6S РНК с РНК-полимеразой. С целью выяснения природы аллостерических взаимодействий между различными функциональными центрами рибосомы, лежащих в основе процессов регуляции трансляции, а также механизма работы антибиотиков, воздействующих на рибосомный туннель (РТ), были проведены молекулярно-динамические (МД) исследования рибосомы, а также был выполнен синтез пептидных производных хлорамфеникола, в которых антибиотик связывается с А-сайтом пептидилтрансферазного центра, а пептидный остаток направлен в РТ в район сенсорных нуклеотидов. МД исследования были направлены на детальный анализ конформационной подвижности сегмента стенки туннеля рибосомы E. coli, образованного участком 2058-2063 полинуклеотидной цепи 23S рРНК, а также примыкающим к нему в третичной структуре рибосомы модифицированным нуклеотидным остатком m2A2503. Этот сегмент макромолекулы 23S рРНК рассматривается в литературных источниках как один из наиболее вероятных участников процесса передачи функциональных сигналов из внутренних районов РТ в ПТЦ рибосомы. В результате анализа молекулярно-динамических траекторий для исследуемой системы нами были обнаружены конформационные переходы, затрагивающие как нуклеотидные остатки изучаемого сегмента РТ (A2058, A2059, C2063, G2061, A2062), так и некоторые нуклеотидные остатки, участвующие в функционировании ПТЦ рибосомы (U2585). Для изучения функциональных сигналов рРНК экспериментальными методами синтезированы трипептидные производные хлорамфеникола. Структуры производных хлорамфеникола были выбраны на основе виртуального скрининга комплексов всех трипептидных производных хлорамфеникола с 50S субъединицей рибосомы E. сoli. Для оптимизации структуры олигонуклеотидных ингибиторов взаимодействия TAR РНК и кTAR синтезированы производные олигонуклеотидного ингибитора взаимодействия TAR РНК и кTAR, содержащие на 3’-конце гидрофобные остатки холестерина или олеиновой кислоты. Для исследования транспорта этих производных в клетки на их 5’-конец присоединен флуорофор гексахлорфлуоресцеин. Соединение, содержащее остаток олеиновой кислоты, в клетки практически не проникало. Олигонуклеотид, конъюгированный с холестерином, в основном связывался с клеточными мембранами, однако часть его проникала в цитоплазму, где локализовалась в виде точечных структур, предположительно в эндосомальных пузырьках. Теломераза – фермент, удлиняющий концы линейных хромосом эукариот (теломеры). Теломеры защищают концы хромосом от потери генетической информации в результате укорочения в каждом раунде клеточного деления. Теломераза человека активна в половых, стволовых, эмбриональных клетках. По мере развития организма и дифференцировки клеток происходит инактивация этого фермента. Теломераза неактивна в соматических клетках, но в большинстве раковых клеток активность фермента восстанавливается. Два основных компонента: теломеразная РНК и теломеразная обратная транскриптаза – входят в состав активного холофермента. Экспрессия теломеразной обратной транскриптазы тонко регулируется на разных этапах жизни клеток. Теломеразная РНК экспрессируется постоянно, она очень стабильна и находится практически во всех клетках человеческого организма. Первоначально теломеразная РНК была открыта как некодирующая РНК. Она содержит матрицу для синтеза теломер, а также является структурным каркасом для фермента. Анализ первичной структуры теломеразной РНК позволил предположить кодирующий потенциал этой РНК. Мы выявили открытую рамку считывания, входящую в состав первичного транскрипта гена теломеразной РНК. На данном этапе в рамках выполнения работ по проекту, используя масс-спектрометрический подход, мы получили прямые доказательства наличия эндогенного белка hTERP в клетках человека. Одно из направлений проекта – исследование функций теломеразной РНК (TER), альтернативных функциям матрицы для синтеза теломерных повторов и платформы для сборки теломеразного комплекса. В 2013 году на кафедре химии природных соединений на модельном организме было показано, что TER может участвовать в процессе ограничения длины теломер. Это новая функциональная особенность теломеразной РНК и первый случай, когда система ограничения длины теломер закодирована непосредственно в теломеразной РНК. Мы предположили возможный контроль этого процесса особой структурой в теломеразной РНК. Для доказательства этого необходимо было разработать эффективный метод тестирования процесса, не основанный на глубоком секвенировании. Такой метод был разработан и опробован, что, возможно, позволит на следующем этапе проверить предположительные дополнительные детерминанты этого процесса в структуре теломеразной РНК модельного организма, оценить возможность их поиска в теломеразной РНК человека и спланировать способы влияния на этот процесс. Искусственное восстановление любой системы ограничения длины теломер – это возможность ограничить количество делений опухолевой клетки с активной теломеразой. Ранее на модельном организме D. rerio нами было показано, что некоторые внутренние участки генома, которые ограничены инвертированными теломерными повторами, транскрипционно активны. Так была выявлена новая длинная некодирующая РНК TREPRA (Telomere Repeat RNA), которая транскрибируется с участка генома, ограниченного внутренними теломерными повторами, ассоциированными с повторяющимися элементами генома. На культуре фибробластов этого организма нами было показано, что TREPRA образует специфические кластерные структуры в ядрах, морфология которых изменяется в стареющих фибробластах. На данном этапе проекта похожие РНК-зависимые структуры, в формировании которых принимает участие TREPRA, были выявлены также на срезах эмбрионов D. rerio. Таким образом, впервые было показано наличие подобных РНК-кластеров не только в культуре клеток, но и в организме D. rerio. Этот факт делает осмысленным экспериментальный поиск гомологов этой РНК у человека.