ИСТИНА

Цель заявляемого проекта – создание спектрофотометрических и флуоресцентных сенсоров на основе полимерных пленок и каталитических индикаторных систем, обладающих высокими избирательностью и чувствительностью к биологически активным органическим субстратам (замещенным фенолам, катехоламинам, флавоноидам, органическим пероксидам) оксидоредуктаз, определение которых чрезвычайно актуально в матрицах сложного состава (в том числе нерастворимых в воде) – лекарственных средствах, биологических жидкостях, косметических и пищевых объектах. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: - получить оптические пленки на основе природных полимеров (хитозана, желатины, целлюлозы, в том числе целлюлозы с ионной жидкостью, ИЖ) с импрегнированными в них распознающими молекулами (индикаторными веществами, молекулами-рецепторами, ферментами); - установить оптимальные состав, структуру, размер и форму пленок для их дальнейшего использования в качестве биочувствительного элемента оптического сенсора; изучить морфологию полученных полимерных плёнок; оптимизировать условия их хранения и эксплуатации; - целенаправленно выбрать индикаторные вещества, молекулы-рецепторы, ферменты (пероксидазы, лакказы, тирозиназы) для создания аналитических спектрофотометрических и флуориметрических систем для высокочувствительного и селективного определения замещенных фенолов, катехоламинов, флавоноидов, органических пероксидов; - выяснить оптимальные условия получения эффективного аналитического сигнала оптических сенсоров на основе пленок природных полимеров в реакциях окисления/восстановления модельных субстратов растительных пероксидаз, лакказ, тирозиназ (фенолов, катехоламинов, пероксидов) в водных и водно-органических средах, используемых в пробоподготовке реальных объектов; - aпробировать разработанные сенсоры для определения ограниченно растворимых в воде и среднеокисляемых органических субстратов пероксидаз в водных и водно-органических растворах фармацевтических препаратов, косметических, пищевых продуктов, в биологических жидкостях.

Проведенное исследование посвящено созданию оптических биосенсоров на основе полимерных пленок и ферментативных индикаторных систем, обладающих высокими избирательностью и чувствительностью к биологически активным органическим субстратам оксидоредуктаз - фенольным соединениям, в том числе катехоламинам, фенотиазинам, и пероксидам в объектах сложного состава (в том числе нерастворимых в воде). В качестве биологических катализаторов выбраны растительные пероксидазы (из корней хрена, ПХ, и шелухи сои, ПС), лакказа, тирозиназа. Предложены конструкции флуориметрических биосенсоров; получены, изучены и охарактеризованы оптические пленки на основе полимеров (хитозана, желатины, целлюлозы с ионной жидкостью, ИЖ) с импрегнированными в них распознающими молекулами (ферментами, индикаторными веществами); выбраны оптимальные биокатализаторы, индикаторные вещества (ароматические диамины), обеспечивающие максимальный и воспроизводимый аналитический сигнал плёнок в водных и водно-органических средах. Разработаны методики прочного закрепления индикаторных веществ (без вымывания реагентов в процессе анализа) в матрицах биораспознающего слоя, закрепленных на поверхности оптических стекол или зеркальных пластинок. Особенность сенсорных систем заключается в том, что регистрируемый аналитический сигнал формируется не в растворе, содержащем аналит, а непосредственно в биочувствительном слое сенсора. Созданные оптические биосенсоры позволяют анализировать мутные среды, объекты с нерастворимой в воде сложной по составу матрицей без предварительного отделения ее компонентов, т.е. без подготовки проб образцов. Разработанный для определения фенольных соединений флуориметрический сенсор на основе двухслойных пленок {хитозан-о-фенилендиамин/хитозан-пероксидаза} по чувствительности (определяемые концентрации - мкМ-нМ) и воспроизводимости значительно превосходит описанные в литературе аналоги. Предложены новые индикаторные системы для определения пероксидов с помощью флуоресцентного биосенсора: реакция взаимодействия хитозана, меченного флуоресцентной меткой (родамина Б изотиацианатом), с продуктами ферментативного окисления пероксидом фенолов с образованием нефлуоресцирующих соединений (обратное определение по тушению флуоресценции); а также реакция ферментативной дериватизации катехоламинов с о-фенилендиамином, включенным в биочувствительный слой сенсора (прямое определение по усилению флуоресценции). Такие индикаторные системы ранее не использовались в сенсорных технологиях. С использованием гидрофильных ИЖ получены оптически прозрачные, тонкие, гибкие и прочные пленки состава {целлюлоза–[BMIm][Cl]/[BMIm][АсО]––пероксидаза}, характеризующиеся высокой каталитической активностью, стабильностью и субстратной специфичностью. На примере использования красителей индигокармина (ИК) и пиронина Б показано, что аналитический сигнал целлюлозных пленок можно регистрировать спектрофотометрическим и флуоресцентным методами соответственно. Нековалентно иммобилизованные в целлюлозных пленках ПХ и ПС сохраняют соответственно не менее 54 и 58% первоначальной каталитической активности при высоком (96.6 масс.%) содержании ИЖ в смеси с целлюлозой и высокой (85?C) температуре расплава. Целлюлозную пленку можно использовать не менее двух раз, если сразу после измерения скорости индикаторной реакции ее тщательно промыть водой. Для сохранения первоначальной каталитической активности в течение недели целлюлозные пленки с иммобилизованными ПХ и ПС следует хранить в набухшем состоянии в закрытом контейнере при комнатной температуре (20?25?C). Через 35 дней хранения остаточные активности ПХ и ПС в пленках составляют 80 и 70% соответственно. Для выбора индикаторных систем для создания на основе полученных целлюлозных пленок оптических сенсоров для определения лекарственных препаратов, в частности эндопероксида артемизинина (АМ), изучены реакции окисления артемизинином пиронина Б, катализируемые микропероксидазой и комплексом {Mn(II)?ДДС}. Разработаны флуориметрические методики определения АМ с использованием указанных систем и апробированы в анализе фармацевтических препаратов на основе полыни Artemisia annua L. используемых для лечения малярии, а также ряда онкологических заболеваний. Создан комплекс чувствительных методик определения ограниченно растворимых в воде органических субстратов пероксидаз, лакказы, тирозиназы - замещенных фенолов и катехоламинов, органических пероксидов в водных и водно-органических растворах фармацевтических препаратов, косметических и пищевых продуктов. Конструкционные особенности, свойства и аналитические характеристики предложенных сенсоров соответствуют мировому уровню. Все перечисленные результаты являются новаторскими и важными для дальнейших успешных исследований, направленных на развитие оптических биосенсоров на основе полимерных пленок.