![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Метилирование ДНК играет значительную роль в контроле экспрессии генов, поддержании целостности генома, эмбриогенезе, инактивации Х-хромосомы и других процессах. В различных типах опухолей меняется характер метилирования ДНК. Однако не известно, как это связано с функционированием ДНК-метилтрансфераз (МТаз). Особенно мало изученной является МТаза Dnmt3a, осуществляющая de novo метилирование цитозина в CpG-сайтах. Для нее не определена роль ряда консервативных аминокислотных остатков. Появились указания на наличие мутаций отдельных аминокислот в Dnmt3a при онкологических заболеваниях. Неизвестно, какие этапы метилирования могут быть при этом нарушены. Другая проблема состоит в том, что Dnmt3а in vivo взаимодействует с хроматином и необходимо рассматривать процесс метилирования в этом контексте. Наконец, важно установить, как может измениться метилирование МТазой Dnmt3a клеточной ДНК, которая повреждена по остаткам гуанина в СрG-сайтах загрязнителями окружающей среды или лекарственными препаратами. С учетом перечисленных проблем предлагаемый проект сфокусирован на исследовании молекулярных основ функционирования МТазы мыши Dnmt3a и особенностей ее действия на поврежденные ДНК-субстраты, в том числе в условиях, приближающихся к условиям in vivo. Предполагается (1) изучить особенности каталитического механизма Dnmt3a, включая определение кинетических параметров реакции и роли отдельных аминокислотных остатков (включая мутированные при раке) на различных стадиях реакции метилирования; (2) детально исследовать влияние повреждения ДНК при действии противоракового препарата 6-тиогуанина на функционирование Dnmt3a и (3) исследовать взаимодействие Dnmt3a с ДНК в составе нуклеосомы, в том числе с нуклеосомной ДНК, поврежденной канцерогеном бензо[a]пиреном. Полученная информация внесет вклад в понимание механизма действия Dnmt3a на молекулярном уровне в клетке.
Исследованы молекулярные основы функционирования ДНК-метилтрансферазы (МТазы) мыши Dnmt3a и особенности ее действия на поврежденные ДНК-субстраты, в том числе в условиях, приближающихся к условиям in vivo. Обнаружено влияние повреждения ДНК при действии противоракового препарата 6-тиогуанина (sG) на функционирование Dnmt3a: уменьшается эффективность метилирования, что связано с нарушением необходимых структурных перестроек ДНК и контактов в фермент-субстратном комплексе. Остаток SG в ДНК впервые применен в качестве спектроскопической метки для изучения комплексов ДНК с МТазами. Получены нуклеосомы, поврежденные одним из самых распространенных канцерогенов - бензо[а]пиреном и определено, как такое повреждение сказывается на работе Dnmt3a. Определена роль ряда не изученных ранее высоко консервативных аминокислотных остатков Dnmt3a из VI-го и VIII-го мотивов на различных стадиях реакции метилирования. Впервые показано, что два остатка Arg играют ключевую роль в катализе, осуществляемом МТазой Dnmt3a. Этот вывод можно распространить и на другие С5 МТазы, которые содержат в аналогичных позициях мотива VIII два остатка Arg. Полученные данные являются важным шагом в понимании механизма действия эукариотической МТазы Dnmt3a на молекулярном уровне в клетке.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. | Молекулярные основы функционирования эукариотической ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a |
Результаты этапа: Метилирование ДНК играет значительную роль в контроле экспрессии генов, поддержании целостности генома, эмбриогенезе, инактивации Х-хромосомы и других процессах. В различных типах опухолей меняется характер метилирования ДНК. Однако неизвестно, как это связано с функционированием ДНК-метилтрансферазы (МТазы) Dnmt3a, осуществляющей de novo метилирование цитозина в CpG-сайтах. За отчетный год получены первые данные о молекулярных механизмах метилирования МТазой мыши Dnmt3a нативной и поврежденной ДНК. Выделены каталитический домен Dnmt3a (Dnmt3a-CD) и изоформа полноразмерного фермента (Dnmt3a2) в виде гексагистидиновых производных. Проверена гипотеза о способности Dnmt3a-CD осуществлять метилирование одновременно двух СpG-сайтов, разделенных витком спирали. В случае полуметилированных двухсайтовых субстратов при расположении остатков m5С в одной из цепей ДНК метилируется только один из СpG-сайтов, что может быть связано c неоптимальным расположением остатков m5С. Константы диссоциации (Кd) комплексов с участием одно- и двухсайтовых субстратов практически не различаются. Изучено влияние включения противоракового препарата тиогуанина (SG) в ДНК на функционирование Dnmt3a-CD. Получены 30-звенные ДНК-дуплексы, содержащие остаток SG в одном или в двух CрG-сайтах и во фланкирующих CрG-сайты последовательностях (sG-ДНК). Только введение SG в CрG-сайт рядом с цитозином-мишенью приводило к ухудшению метилирования в 4 раза по сравнению с немодифицированным субстратом. Наличие SG напротив цитозина-мишени или во фланкирующей последовательности рядом с ним практически не сказывалось на эффективности метилирования. Сделано предположение, что в первом случае при замене атома кислорода в положении 6 на атом серы нарушается один из важных контактов Dnmt3a-CD с ДНК-субстратом. При этом значения Кd незначительно повышаются вне зависимости от позиции остатка sG в ДНК-дуплексе. Ранее нами показано, что повреждение остатков гуанина в СpG-сайтах канцерогеном бензо[a]пиреном (B[а]P) резко ухудшает метилирование ДНК МТазой Dnmt3a-CD. В этом году было исследовано влияние повреждения ДНК B[а]P на функционирование Dnmt3a2, в состав N-концевого участка которой входит PWWP-домен. Показано, что B[а]P- повреждения, нарушающие структуру СpG-сайта или мешающие контактам каталитической петли фермента с малой бороздкой ДНК, снижают скорости метилирования, причем такие же закономерности характерны и для Dnmt3a-CD. Таким образом, в выбранных условиях PWWP-домен МТазы Dnmt3a2 не влияет на катализ. С целью приближения к условиям in vivo начато исследование взаимодействия Dnmt3a с ДНК в составе нуклеосомы, в том числе с нуклеосомной ДНК, поврежденной B[а]P. В результате многоэтапного синтеза получены 145-звенные немодифицированные и B[а]P-содержащие ДНК. Введены (+)-cis-B[a]P-N2-dG, когда остаток B[а]P интеркалирует в спираль ДНК, и (-)-trans-B[a]P-N2-dG с укладкой B[а]P в малую бороздку. Далее осуществлена реконституция нуклеосом с полученными 145-звенными ДНК. Модифицированные нуклеосомы получены с выходом 60-80%. Для определения в дальнейшем общего уровня метилирования нуклеосомной ДНК и влияния повреждения B[а]P таких ДНК на их метилирование разработан подход, основанный на использовании ультраэффективной жидкостной хроматографии с детекцией методом тандемной квадрупольной масс-спектрометрии. Полученные данные являются важным шагом в понимании механизма действия Dnmt3a на молекулярном уровне в клетке. | ||
2 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Молекулярные основы функционирования эукариотической ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a |
Результаты этапа: Основная цель проекта состоит в исследовании молекулярных основ функционирования ДНК-метилтрансферазы (МТазы) мыши Dnmt3a и особенностей ее действия на поврежденные ДНК-субстраты, в том числе в условиях, приближающихся к условиям in vivo. В отчетном году продолжено исследование влияние повреждения ДНК при действии противоракового препарата 6-тиогуанина (sG) на функционирование Dnmt3a. Уменьшение эффективности метилирования при введении остатка sG в CpG- сайте, обнаруженное в первый год выполнения проекта, может быть связано с нарушением необходимых структурных перестроек ДНК в фермент-субстратном комплексе. Для решения этого вопроса был применен метод кругового дихроизма (КД) в области поглощения SG, в которой немодифицированные азотистые основания и белки оптически прозрачны. Подобраны условия и получены первые данные по КД комплексов Dnmt3a-CD с sG-ДНК, позволяющие анализировать локальные конформационные изменения ДНК-субстрата. Остаток SG в ДНК впервые применен в качестве спектроскопической метки для изучения комплексов с С5-МТазами (метилируют С5-положение цитозина). Ранее нами обнаружено существенное влияние повреждения ДНК одним из самых распространенных канцерогенов - бензо[а]пиреном (B[а]P) - на метилирование ДНК каталитическим доменом МТазы Dnmt3a (Dnmt3a-CD). Начато исследование влияния такого повреждения ДНК в составе нуклеосомы, как элементарной единицы хроматина, на функционирование полноразмерной МТазы мыши Dnmt3a2. Впервые показано, что Dnmt3a2 связывается со свободной 145-звенной ДНК, поврежденной B[а]P, и с нуклеосомой, содержащей эту ДНК. Неповрежденная нуклеосомная ДНК метилируется МТазой Dnmt3a2 в 9-27 раз хуже, чем ДНК, не связанная с гистоновыми белками. Степени метилирования немного повышались при включении (+)-cis-B[a]P-dG- и (-)-trans-B[a]P-dG – аддуктов в нуклеосомные ДНК. Роль консервативных аминокислотных остатков из VI-го и VIII-го мотивов Dnmt3a на различных стадиях реакции метилирования практически не исследована. Так, не определена природа контактов консервативных для С5-МТаз остатков Arg200 и Arg202 с ДНК. Нами впервые показано, что замещение остатка Arg200 на другие аминокислоты не играет ключевой роли в образовании комплекса Dnmt3a-CD с ДНК-субстратом, но ведет к потере ферментативной активности фермента. Полученные данные являются важным шагом в понимании механизма действия Dnmt3a на молекулярном уровне в клетке. | ||
3 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Молекулярные основы функционирования эукариотической ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a |
Результаты этапа: Исследованы молекулярные основы функционирования ДНК-метилтрансферазы (МТазы) мыши Dnmt3a и особенности ее действия на поврежденные ДНК-субстраты, в том числе в условиях, приближающихся к условиям in vivo. Обнаружено влияние повреждения ДНК при действии противоракового препарата 6-тиогуанина (sG) на функционирование Dnmt3a: уменьшается эффективность метилирования, что связано с нарушением необходимых структурных перестроек ДНК и контактов в фермент-субстратном комплексе. Остаток SG в ДНК впервые применен в качестве спектроскопической метки для изучения комплексов ДНК с МТазами. Получены нуклеосомы, поврежденные одним из самых распространенных канцерогенов - бензо[а]пиреном и определено, как такое повреждение сказывается на работе Dnmt3a. Определена роль ряда не изученных ранее высоко консервативных аминокислотных остатков Dnmt3a из VI-го и VIII-го мотивов на различных стадиях реакции метилирования. Методом сайт-направленного мутагенеза получены мутантные формы Dnmt3a-CD, несущие замены высоко консервативных остатков Asn167, Arg200 и Arg202. Исследована их метилирующая активность, способность связываться с субстратом, выпетливать цитозин-мишень из двойной спирали и образовывать переходной ковалентный комплекс с ДНК. Мутации по остаткам Arg200 и Arg202 приводят к потере всех этих свойств. Замещение по Asn167 приводит к уменьшению каталитической активности и выпетливания цитозина. Таким образом, Arg200 и Arg202 играют ключевую роль в катализе, осуществляемом Dnmt3a. Этот вывод можно распространить и на другие С5 МТазы, которые содержат в аналогичных позициях мотива VIII два остатка Arg. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".