ИСТИНА

Процессы репарации ДНК эукариот важны для нормального функционирования клеток и осуществляются в контексте хроматина. В то же время механизмы репарации ДНК в хроматине, сопровождающиеся его ремоделированием, недостаточно изучены. В данном Научном проекте будут изучаться механизмы узнавания биологически значимых одно- и двунитевых (липких и тупых) разрывов ДНК белками PARP1 и PARP2 в хроматине in vitro. Ранее нами было показано, что PARP1 способен обратимо реорганизовывать структуру нуклеосомы при связывании с двуцепочечными разрывами ДНК. В настоящем проекте будет продолжен анализ механизмов репарации повреждений ДНК различных типов белками PARP1 и PARP2, которые обладают различной специфичностью по отношению к разным повреждениям ДНК. Анализ механизмов действия PARP1 и PARP2 будет проводиться с использованием адаптированного нами современного метода флуоресцентной микроскопии одиночных молекул (spFRET) в сочетании с более традиционными биохимическими и молекулярно-биологическими методами, а также с использованием методов молекулярного моделирования. Кроме того, будут изучены механизмы действия различных ингибиторов этих белков, в том числе нового, открытого нами природного ингибитора 7-метилгуанина, а также олапариба и госсипола в контексте хроматина. Поскольку олапариб и госсипол используюся при лечении злокачественных опухолей, полученные данные помогут усовершенствовать имеющиеся на данный момент схемы химиотерапии.

(1) Будет разработана новая экспериментальная система для изучения механизмов узнавания биологически значимых одно- и двуцепочечных повреждений ДНК в составе нуклеосом белками, участвующими в репарации PARP1 и PARP2; (2) Будут получены данные по связыванию белков PARP1 и PARP2 с повреждениями ДНК в хроматине – модифицированными одно- и двуцепочечными (липкими и тупыми) концами, в т.ч. содержащих 5’-OH, 3’-P, тимингликолевые и фосфогликолятные производные, образующиеся in vivo; (3) Будут получены данные о ферментативной активности белков PARP , приводящей к автомодификации и/или PARилированию коровых гистонов, в присутствии биологически значимых одно- и двунитевых разрывов ДНК (см выше); (4) Будет описан механизм глобальной реорганизации нуклеосомной ДНК в присутствии биологически значимых одно- и двунитевых разрывов ДНК (см выше) факторами PARP; (5) Будут протестировано влияние ранее известных ингибиторов PARP – олапариба и госсипола – на связывание белка PARP2 c повреждениями хроматина методами EMSA и изменения структуры нуклеосом методами gel-FRET и gel-spFRET; (6) Будет смоделировано взаимодействие нового, открытого нами природного ингибитора 7-метилгуанина, с каталитическими доменам белков PARP1 и PARP2; (7) Будет экспериментально исследовано влияние ингибитора 7-метилгуанина на взаимодействия белков PARP1 и PARP2 с повреждениями ДНК в структуре хроматина; (8) Будут получены данные о влиянии олапариба и госсипола на способность PARP2 к активации в присутствии различных повреждений ДНК в хроматине (см выше), в также на способность к глобальной реорганизации нуклеосомной ДНК и степени таких изменений.

К научному заделу следует отнести разработанные нами методики анализа взаимодействия комплексов нуклеосом с белками PARP с использованием методов FRET-микроскопии одиночных молекул (spFRET), EMSA и высокопроизводительного молекулярного компьютерного моделирования. Нами были получены предварительные данные о взаимодействии PARP1 с двуцепочечными разрывами ДНК, расположенными на расстоянии 20 п.н. от нуклеосомного кора. Мы также обнаружили, что олапариб не влияет на связывание PARP1 с нуклеосомами и разворачивание нуклеосомной ДНК, но препятствует активации фермента. Нам также удалось разработать и оптимизировать метод gel-FRET (наблюдение эффекта FRET в геле) для изучения образования комплексов нуклеосома:PARP. При изучении комплексов нуклеосома:PARP1 при высокой концентрации PARP1 мы обнаружили несколько дискретных полос на геле, которые отличаются по стехиометрии связывания PARP1 и степени отворачивания нуклеосомной ДНК от гистонового кора. Наконец, нами ведется разработка метода gel-spFRET, позволяющий анализировать флуоресценцию одиночных молекул и комплексов, предварительно разделенных в полиакриламидном геле методом электрофореза. Данный метод позволяет дифференцировать сигналы флуоресценции от разных комплексов, тем самым получая информацию о различных популяциях частиц в одном образце по отдельности. Участники проекта являются высококвалифицированными специалистами в области биохимии и молекулярной биологии хроматина и молекулярного моделирования белковых структур и их комплексов с лигандами, в том числе с нуклеиновыми кислотами. Кроме того, сотрудники лаборатории обладают большим опытом в изучении динамики хроматиновых структур методом spFRET, в том числе комплексов PARP1 с нуклеосомами. Предлагаемый для исследований в проекте новый ингибитор PARP1 и PARP2, 7-метилгуанин, был разработан нами с использованием вычислительных подходов и компьютерного скрининга.