Ионофорные свойства как основа терапевтического и цитотоксического действия нового протонофора - глутамат-замещенного производного грамицидина АНИР

Ionophore properties as the basis of therapeutic and cytotoxic effect of new protonophore - glutamate-substituted derivative of gramicidin And

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Ионофорные свойства как основа терапевтического и цитотоксического действия нового протонофора - глутамат-замещенного производного грамицидина А
Результаты этапа: Были синтезированы два новых пептида [His3]gA и [His1]gA. Была исследована их протонофорная активность на липосомах, содержащих рН индикатор пиранин. Оказалось, что оба пептида проявляют протон-транспортные свойства, причем пептид [His3]gA имеет большую активность. Кроме того, была исследована их активность по сбросу потенциала выделенных митохондрий печени крысы. Оказалось также, что [His3]gA сбрасывал потенциал митохондрий при меньших концентрациях по сравнению с [His1]gA. Вышеописанные измерения были сделаны при нейтральных значениях рН. Было показано, что при таких рН пептиды [His3]gA и [His1]gA не индуцируют неселективную утечку красителя (сульфородамина Б) из липосом в отличие от пептида [Lys3]gA, который проявлял большую активность и вызывал выход как сульфородамина Б, так и флуоресцентно-меченого декстрана с молекулярной массой 3 кДа.
2 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Ионофорные свойства как основа терапевтического и цитотоксического действия нового протонофора - глутамат-замещенного производного грамицидина А
Результаты этапа: 1. Синтезированы N-замещенные аналоги грамицидина А с заменой аминокислотных остатков в первом и третьем положении на цистеин [Cys1]gA и [Cys3]gA. 2. Изучена стимуляция дыхания митохондрий из печени крысы под действием синтезированных аналогов грамицидина А с заменой аминокислотных остатков в первом или третьем положении на цистеин или гистидин. Данные по стимуляции дыхания митохондрий (в качестве субстрата использовался сукцинат) показали, что действующие концентрации [Cys1]gA и [Cys3]gA практически совпадают с таковыми у грамицидина А. При этом в случае [His3]gA, и особенно [His1]gA для стимуляции дыхания требовались гораздо большие концентрации, чем в случае gА. Так для [His1]gA сдвиг по концентрациям составлял приблизительно десять раз. 3. Проведенные опыты показали, что как сам gА, так и его аналоги, не ингибируют дыхания митохондрий даже при добавлении очень высоких концентраций (вплоть до 10 мкг/мл). В этом плане их действие сильно отличается от действия классических разобщителей, таких как ДНФ и FCCP, стимулирующее действие которых сменяется ингибирующим при возрастании концентрации в несколько раз. 4. Способность пептидов перераспределяться между мембранами изучена на смеси пустых липосом и липосом, нагруженных рН-чувствительным красителем пиранином. Для этого перед добавлением липосом, нагруженных пиранином, проводилась инкубация gA или [Glu1]gA с липосомами из яичного лецитина, не содержащими пиранин, которая приводила к встраиванию пептидов в мембраны этих липосом. В момент добавления в среду липосом с пиранином протонофорная активность gA/[Glu1]gA оказывается подавленной по сравнению с ситуацией, когда пираниновые липосомы добавлялись одновременно с пустыми, что можно связать с понижением концентрации свободных пептидов в растворе в результате их связывания с пустыми липосомами. Вначале была изучена зависимость степени подавления эффекта gA и [Glu1]gA от концентрации пустых липосом при фиксированном времени их инкубации с пептидами. Полученные данные указывают на обратную зависимость между количеством ненагруженных липосом и эффектом gA/[Glu1]gA на липосомы, нагруженные пиранином. При другой постановке опытов, когда концентрация пустых липосом была фиксированной, а варьировалось время инкубации с ними, протонофорное действие [Glu1]gA на липосомы, нагруженные пиранином, зависело от времени инкубации в меньшей степени, чем в случае gA. Это можно объяснить тем, что глутаматный аналог грамицидина, уже находясь в мембране пустой липосомы, может перераспределиться в мембрану пираниновых DPhPC липосом быстрее, чем грамицидин А. 5. Для определения соотношения калий-протонной селективности были поставлены опыты по измерению сдвига потенциала нулевого тока для этих пептидов при создании градиента рН в среде с 100 мМ KCl. При этом были выбраны значения рН 4 и 3.4 (то есть достаточно кислый диапазон рН) для того, чтобы увеличить точность таких измерений. Оказалось, что для двух пептидов величина потенциала нулевого тока оказалась одинаковой и составила около 15 мВ. Таким образом, гипотеза об изменении селективности канала грамицидина при введении глутамата в первое положение как первопричине сниженной цитотокcичности не соответствует экспериментальным данным.
3 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Ионофорные свойства как основа терапевтического и цитотоксического действия нового протонофора - глутамат-замещенного производного грамицидина А
Результаты этапа: Проект направлен на поиск новых нетоксичных протонофоров, которые могут быть использованы в качестве терапевтических средств при борьбе с ожирением и для снижения уровня патологий, связанных с окислительным стрессом. Ранее в нашей лаборатории среди множества пептидов-производных грамицидина А был идентифицирован пептид [Glu1]gA (аналог грамицидина с заменой остатка валина в первом положении на глутаминовую кислоту) с уникальными характеристиками: при сохранении протонофорной активности [Glu1]gA проявлял существенно меньшую цитотоксичность по сравнению с самим грамицидином А и обладал нейропротекторными свойствами. В ходе выполнения настоящего проекта синтезированы и изучены пептиды с введением в первое или третье положение грамицидина А остатков гистидина ([His3]gA и [His1]gA) или цистеина ([Cys1]gA и [Cys3]gA), способных так же, как и глутамат, протонироваться-депротонироваться при физиологических значениях рН. Протонофорная активность новых пептидов [His3]gA и [His1]gA была исследована на липосомах, содержащих рН-индикатор пиранин и на выделенных митохондриях печени крысы по сбросу мембранного потенциала. Оказалось, что оба пептида обладают протон-транспортными свойствами, причем пептид [His3]gA проявляет более высокую активность. Данные по стимуляции дыхания митохондрий под действием синтезированных аналогов грамицидина А показали, что действующие концентрации [Cys1]gA и [Cys3]gA практически совпадают с таковыми у грамицидина А. При этом в случае [His3]gA, и особенно [His1]gA для стимуляции дыхания требовались гораздо большие концентрации, чем в случае грамицидина А. Существенно, что как сам грамицидин А, так и его аналоги, не ингибировали дыхания митохондрий даже при очень высоких концентрациях в отличие от классических разобщителей, таких как ДНФ и СCCP, стимулирующее действие которых сменяется ингибирующим при возрастании концентрации в несколько раз. Показано, что ионная селективность [Glu1]gA не отличается от ионной селективности грамицидина А, тем самым установлено, что различие в ионной селективности не является причиной сниженной цитотоксичности [Glu1]gA по сравнению с грамицидином А. С другой стороны, показано, что [Glu1]gA обменивается и перераспределяется в липосомах быстрее, чем грамицидин А. Предположительно, способность к быстрому перераспределению и определяет повышенную терапевтическую эффективность [Glu1]gA. Нами тщательно изучена каналообразующая активность [Glu1]gA в плоских бислойных липидных мембранах (БЛМ). [Glu1]gA проявлял способность индуцировать как макроскопический ток, так и одиночные каналы в широком диапазоне рН, хотя и с более низкой эффективностью, чем исходный грамицидин A. Записи одиночных каналов [Glu1]gA в 1 М KCl при рН 4 содержали открытые состояния одного типа с проводимостью (около 26 пс), аналогичной таковой для грамицидина A, и временем жизни (40 мс), намного короче, чем у грамицидина A. При рН 9, напротив, были обнаружены две популяции каналов, одна из которых имела гораздо большую продолжительность жизни (несколько секунд) и более низкую проводимость (3,5 - 10 пс). Автокорреляционная функция шума тока [Glu1]gA выявила заметный сдвиг в сторону более длительных времен корреляции при подщелачивании. Метод сенсибилизированной фотоинактивации грамицидиновых каналов также выявил качественные различия в свойствах каналов при щелочных и кислых рН, что выражалось в их различной чувствительности к фотодинамическому воздействию и замедлении кинетики при защелачивании раствора. Наклон концентрационной зависимости индуцированной [Glu1]gA-аналогом проводимости БЛМ в двойных логарифмических координатах оказался близок к 3, что указывало на агрегацию пептида в мембране. По всей видимости, pH-зависимая агрегация [Glu1]gA обусловлена депротонированием глутамата при щелочных pH. Сравнение одностороннего и двустороннего добавления пептида в омывающие БЛМ растворы при разных рН показало, что основной вклад в проводимость дают димеры пептида голова-к-голове, а не двойные спирали. Наши предыдущие работы показали, что в случае выделенных митохондрий активность пептидов [Glu1]gA и грамицидина A в отношении сброса мембранного потенциала митохондрий практически одинакова, тогда как их протонофорная активность в искусственных бислойных липидных мембранах (моноламеллярных липосомах и плоских липидных бислоях) существенно различается, а именно: в моноламеллярных липосомах грамицидин A был существенно более активным по сравнению с [Glu1]gA (Sorochkina et al., 2012). Для выяснения причины такого различия, нами были поставлены опыты на субмитохондриальных частицах (СМЧ), митопластах и мультиламеллярных липосомах. Оказалось, что в таких препаратах [Glu1]gA был значительно менее активным протонофором, чем gA. На основании этих результатов можно заключить, что в митохондриях внешняя мембрана, которой лишены СМЧ и митопласты, по-видимому, является значительным барьером для грамицидина A по сравнению с [Glu1]gA.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".