ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ФНКЦ РР |
||
В задачи данной работы входила проверка возможности получения комплекса альдолазы FbaВ из E.coli с кетосодержащим субстратом (фруктозо-1,6-бисфосфатом или же с диоксиацетонфосфатом), стабилизированного последующей обработкой боргидридом натрия NaBH4. Второй задачей настоящей работы было получение комплекса FbaВ с аллостерическим эффектором (АТР) или его аналогом. Чтобы выявить сайт связывания АТР на FbaВ и прояснить пути его эффекторного влияния, необходимо стабилизировать комплекс FbaВ с АТР путем ковалентной модификации. В работе была протестирована возможность связывания с FbaВ АМР, окисленного по гидроксильным группам под действием периодата натрия. Полученное ковалентное производное FbaB было также стабилизировано NaBH4. Был проведен скрининг условий кристаллизации двух ковалентных производных белка, подобраны условия кристаллизации в капле.
Производное FbaВ по активному центру с модификацией под действием субстрата было получено и стабилизировано NaBH4. Включение субстрата (диоксиацетонфосфата) было показано масс-спектрометрически. Модификация по активному центру была доказана полным исчезновением каталитической активности. Была разработана методика получения производного FbaB с различной стехиометрией модификации. Производное FbaB по аллостерическому центру с модификацией под действием реакционноспособного аналога АТР было получено и также стабилизировано NaBH4. Количественно включение адениновой группировки в белок определяли спектрофотометрически. В различных аналитических экспериментах включение составляло от 1,0 до 2,2 моль на моль белка; для препаративного получения были выбраны условия, в которых степень модификации близка к стехиометрической (1:1). Стабилизированные производные белка после осаждения сульфатом аммония были наработаны препаративно, очищены хроматографически, сконцентрированы и далее использованы для скрининга условий кристаллизации. Для обоих производных FbaВ были подобраны условия кристаллизации в висячей капле. Они могут служить основой для подбора условий кристаллизации в капиллярах, пригодных для использования в условиях микрогравитации на РС МКС.
Хоздоговор, «МКС» (Надежность-Наука) ИК – 3 |
# | Сроки | Название |
1 | 30 июня 2014 г.-10 октября 2014 г. | Получение и кристаллизация комплексов фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы из E.coli |
Результаты этапа: Объектом настоящего исследования является бактериальный фермент метаболизма углеводов, фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза класса I из Escherichia coli (FbaB). В результате выполнения СЧ ОКР были получены два ковалентных производных этого фермента. На первом этапе с целью идентификации сайта связывания АТР была получена FbaB, модифицированная аналогом АМР, окисленным под действием периодата натрия. Полученный комплекс был далее стабилизирован под действием боргидрида натрия. Были подобраны условия, позволяющие получить производное белка со стехиометрическим включением модификатора (1:1). На второй стадии работы было получено производное FbaB с кето-содержащим субстратом (диоксиацетонфосфатом), стабилизированное боргидридом натрия. Для обоих производных FbaB были подобраны условия кристаллизации, позволяющие получить кристаллы дифракционного качества. Они могут служить основой для подбора условий кристаллизации в капиллярах, пригодных для использования в условиях микрогравитации на РС МКС. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".