ИСТИНА

Проект направлен на создание новых ингибиторов амилоидной агрегации на основе природных полифенолов и их аналогов. Основным объектом исследования будет прион, белок, способный при переходе в амилоидную форму вызывать нейродегенеративные заболевания животных и человека. В настоящее время известно несколько десятков соединений полифенольной природы, способных влиять на процесс амилоидной агрегации, однако механизм их действия по-прежнему неясен. Наибольший интерес представляют полифенолы растительного происхождения, так как они зачастую могут использоваться в пищу, не токсичны и могут применяться для профилактики нейродегенеративных заболеваний. Известно, что наиболее перспективно создание ингибиторов на основе соединений, способных связываться с прионом на ранних стадиях патологического процесса и блокировать его развитие. В данной работе на первом этапе предполагается провести исследование связывания полифенолов и их аналогов с разными патологическими формами приона методами молекулярного моделирования. С помощью методов молекулярной динамики будут выявлены предположительные места связывания известных лигандов, а затем проведено моделирование связывания соединений, имитирующих разные вероятные состояния молекулы выбранного полифенола, для поиска наиболее эффективной формы. Как правило, растительные полифенолы представляют собой полиненасыщенные органические соединения, содержащие одно или несколько полигидроксилированных ароматических или гетероароматических ядер. Ввиду существенного структурного разнообразия для природных полифенолов характерно сложное конформационное равновесие, обеспечивающее широкий спектр проявляемой данным классом соединений биологической активности. Кроме того, синтетическая доступность большого набора модифицированных полифенолов обеспечивает высокий потенциал для создания молекул, обладающих более высоким сродством к целевому белку. В частности, предполагается моделирование заместителей в фенольных группах для повышения энергии связывания с аминокислотным окружением в сайте связывания ингибитора. После этапа моделирования ингибиторов на основе природных полифенолов и изучения их связывания методами молекулярного моделирования и докинга, планируется экспериментальная проверка эффективности связывания и влияния на амилоидную агрегацию приона с использованием различных физико-химических методов, а также клеточных моделей.

2386/5000 The project aims at the creation of new amyloid aggregation inhibitors based on natural polyphenols and their analogues. The main object of the study will be a prion, a protein capable of the transition in the form of amyloid to cause neurodegenerative diseases of animals and humans. Currently there are several tens of natural polyphenol compounds able to influence the process of amyloid aggregation, but their mechanism of action remains unclear. Of greatest interest are plant polyphenols, as they are often used in food, non-toxic and can be used for the prevention of neurodegenerative diseases. It is known that the most promising is the development of inhibitors based on compounds that bind to prion in the early stages of the disease process and block its development. In this work, the first stage is supposed to undertake a study of binding of polyphenols and their analogues with different forms of pathological prion molecular modeling. With the use of molecular dynamics will be revealed putative binding sites of known ligands, and then to simulate the binding of compounds that mimic the different probable state of the molecule selected polyphenol, to find the most effective form. Typically, plant polyphenols are polyunsaturated organic compounds containing one or more polyhydroxylated aromatic or heteroaromatic nucleus. Due to significant structural diversity of natural polyphenols which have a complex conformational equilibrium, providing a wide range exhibited by this class of biological activity of compounds. Furthermore, a large set of synthetic accessibility modified polyphenols provides a high potential to create molecules with a higher affinity to the target protein. In particular, it is assumed in modeling phenolic substituent groups to increase the binding energy environment with an amino acid in the binding site of the inhibitor. After the modeling phase inhibitors based on natural polyphenols and study their binding molecular modeling and docking planned experimental verification of the effectiveness and binding effect on amyloid aggregation of the prion with various physical and chemical methods, and cellular models.

Основными результатами научной деятельности по проекту будет список предположительных ингибиторов амилоидной агрегации из числа природных полифенолов и их производных, пригодных для создания средств профилактики и лечения амилоидных и нейродегенеративных болезней. Полученные с помощью методов молекулярного моделирования модели трехмерной структуры комплексов приона с лигандами будут использованы для создания производных этих соединений, обладающих большим сродством к сайтам связывания, а, следовательно, и большей противоагрегационной активностью. Кроме того, сравнительный анализ эффективности связывания и предотвращения амилоидной агрегации позволит глубже исследовать механизм конформационного перехода приона в патологическую. На основе проведенного исследования будут предложены соединения, которые в дальнейшем могут быть использованы в качестве ингибиторов патологических нейродегенеративных процессов, характерных не только для прионной инфекции, но и для мозга человека в зрелом возрасте (старческое слабоумие, болезнь Альцгеймера, Паркинсона).

Руководитель проекта работает в области исследований, посвященных амилоидной агрегации белков, начиная со своей диссертационной работы, подтвержденной степенями кандидата биологических наук ВАК и Нантского университета (Франция) в 2010 году. Основным результатом работы является разработка и проверка гипотезы о роли гомоцистеинилирования в развитии амилоидной агрегации и нейродегенеративных заболеваний (Stroylova Y. et al., 2012). Руководитель проекта является высококвалифицированным специалистом в области изучения амилоидогенных белков, главным образом прионов (Stroylova Y. et al., 2009, 2011, 2012), а также белков с частично неупорядоченной структурой (различные молочные казеины (Stroylova Y. et al., 2009, 2009, 2011) и некоторых ферментов (Стройлова(Щуцкая) и др. 2008), участвующих в амилоидогенезе. Авторами созданы полноатомные модели амилоидных белков (прионов и амилоидов) для моделирования их взаимодействия с низкомолекулярными лигандами, проведен широкий предварительный скрининг лигандов амилоидных белков (приона, амилоида, хантингтина) с использованием методов молекулярного моделирования. Также авторами предложены потенциальные сайты связывания лигандов. Систематизирование результатов проведенной работы позволило предположить перспективность более глубокого исследования и поиска ингибиторов амилоидной агрегации среди природных полифенолов. Особенно интересен подход получения производных природных молекул для увеличения их эффективности, повышения растворимости при необходимости, а также возможности подачи оригинальных патентов. В коллективе авторов проекта освоен широкий ряд экспериментальных методов исследования белков, а именно экспрессии и выделения рекомбинантных прионов и специфики работы с белками, склонными к агрегации, дифференциальная сканирующая калориметрия, электронная микроскопия, флуоресцентная микроскопия, динамическое лазерной светорассеяние.

С целью поиска среди природных полифенолов новых ингибиторов, пригодных для создания лекарственных и профилактических средств против нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы, на первом этапе реализации проекта было проведено молекулярное моделирование связывания приона с различными лигандами, а также поиск и скрининг соединений, препятствующих патологической трансформации этих белков. Структуры природных фенолов и полифенолов для проведения виртуального скрининга были получены из группы соединений растительного происхождения базы данных KEGG. На основе наших предварительных данных по предположительному сайту связывания приона с ингибиторами амилоидной трансформации проведен отбор ряда низкомолекулярных соединений, предположительно обладающих профилактическим или лечебным действием без установленного механизма в отношении амилоидных нейродегенеративных заболеваний или способных связываться с прионами, наиболее перспективных для последующего экспериментального исследования. В частности, были исследованы 3,4–диметоксикоричная и феруловая кислоты, являющиеся природными компонентами кофе, а также еще 7 соединений – производных коричной кислоты. В работе проведено экспериментальное изучение влияния отобранных соединений на процессы амилоидогенной трансформации, олигомеризации и агрегации приона с помощью флуоресцентного зонда тиофлавина Т, методом лазерного динамического светорассеяния, и с помощью расщепления протеиназой К. Наиболее эффективное подавление амилоидной агрегации предложенными соединениями было выявлено при использовании метода «затравки», когда агрегацию индуцируют добавлением амилоидных фибрилл в соотношении 1:50. Для исследования механизма действия предложенных соединений на агрегацию амилоидных белков было дополнительно изучено участие различных химических групп в составе полимеров на агрегацию и дезагрегацию приона, для чего использовали полимеры разных типов – пиридин-фениленовые дендримеры и полисульфоанионы. На основании полученных данных было проведено молекулярное моделирование взаимодействия лигандов с разными формами прионного белка и для объяснения возможного механизма действия было выдвинуто предположение о том, что диметоксикоричная кислота связывается с неким промежуточным олигомером приона, и тем самым стабилизирует его структуру, препятствуя дальнейшей агрегации. Данные о связывании диметоксикоричной кислоты с прионом, полученные методом изотермической титрующей калориметрии, свидетельствуют о том, что образующийся комплекс является достаточно прочным и характеризуется константой диссоциации Kd=400 нм. Среди исследованных соединений 3,4-диметоксикоричная и феруловая кислоты являются наиболее перспективными и пригодными для последующего исследования на клеточных моделях амилоидных нейродегенеративных заболеваний, с целью создания новых средств профилактики и лечения заболеваний прионовой природы у человека и животных. По результатам работы опубликовано 5 статей в международных журналах, одна принята к печать, опубликовано 5 тезисов докладов.