Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействияНИР

Molecular mechanisms of cell response to stresses

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа: Установлена субстратная специфичность фитаспазы (растительной протеазы, участвующей в осуществлении программированной клеточной смерти) риса с использованием комбинаторных пептидных библиотек. Показано, что фитаспаза гидролизует пептидную связь исключительно после остатка аспарагиновой кислоты. В то же время, аминокислотный мотив, предшествующий остатку аспартата, существенным образом влияет на эффективность гидролиза. Выяснено, что оптимальный сайт гидролиза фитаспазой имеет последовательность: Ile-Trp-Leu-Asp. Интересной особенностью фитаспазы является выраженное предпочтение к наличию остатка ароматической аминокислоты в положении Р3 в сайте гидролиза. Создана концепция внутриклеточного биогенеза белка NCAPP и его транспорта за пределы клетки. Выявлены гены человека, связанные со стрессом эндоплазматического ретикулума, экспрессия которых дифференциально регулируется при действии ингибитора III комплекса дыхательной цепи митохондрий.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа: 1. Исследование апоптотической протеазы растений. Установлено, что повышение уровня протеолитического фермента фитаспазы в трансгенных растениях томатов усиливает процесс программированной клеточной смерти, а снижение уровня этого фермента, напротив, защищает растительные клетки от гибели, вызванной стрессовыми воздействиями. 2. Генетические и химические основы коммуникации в растительном сообществе. В растениях рода Nicotiana, эффективная стратегия устойчивости к стрессам включает слаженный синтез и накопление белка не-клеточно-автономного пути (non-cell-autonomous pathway protein, NCAPP) и синтез мРНК пектинметилэстеразы (ПМЭ). В 2015 году мы выделили транскрипционный промотор гена ПМЭ (proPME) табака длиной 1500 пар оснований и исследовали его способность направлять синтез GUS в сравнении с proNCAPP и 35S-промотором вируса мозаики цветной капусты. Оказалось, что хотя proPME и менее активен, чем 35S-промотор, он обеспечивает отчетливый синтез GUS. Введение в клетку с помощью агроинфекции генетической конструкции proPME:GUS в присутствии гена, кодирующего NCAPP, позволило оценить способность NCAPP влиять на транскрипционную активность proPME. Оказалось, что NCAPP может подавлять транскрипцию гена GUS, находящегося под контролем proPME. Кроме того, в этом году нам удалось получить трансгенные, стабильно трансформированные растения табака, содержащие генетическую вставку proPME:GUS. В настоящее время проводится анализ трансгенов на способность синтезировать GUS. 3. Механизмы функционирования опухолевого супрессора р53 при стрессовых воздействиях на клетку. Исследовано влияние опухолевого супрессора р53 на индукцию экспрессии мРНК транскрипционного фактора ATF4 и его генов-мишеней ASNS, SLC7A11, TRIB3 при действии ингибитора комплекса I дыхательной цепи митохондрий пирицидина. Подтверждена гипотеза о том, что активация р53 подавляет экспрессию транскрипционного фактора ATF4 и его генов-мишеней при митохондриальной дисфункции. 4. Исследование танкиразы – фермента, катализирующего поли-ADP-рибозилирование белков. Изучено влияние ингибитора танкиразы XAV939 на активность фермента в культуре клеток человека Huh7 и в печени новорожденной мыши. В присутствии ингибитора активность фермента в препаратах дозозависимо падает более, чем в 10 раз. В то же время внутрибрюшинное введение ингибитора мышам к снижению активности в органах и тканях не приводит. При исследовании in vitro обнаружено, что преинкубация XAV939 в течение нескольких часов в присутствии экстракта из печени мыши приводит к заметному снижению эффективности ингибирования, что указывает на нестабильность XAV939 в организме.
4 11 января 2016 г.-30 декабря 2016 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа: Целью НИР является выяснение молекулярных механизмов, отвечающих за защитные реакции клеток растений и животных на стрессовые воздействия. На этапе 2016 года были решены следующие задачи: 1. При исследовании механизмов программированной клеточной смерти растений в ответ на биотические и абиотические стрессы было изучено влияние фитаспазы, апоптотической протеазы растений, на экспрессию генов белков теплового шока. Показано, что фитаспаза способна, непосредственно или опосредовано, влиять на экспрессию генов растений. 2. При изучении молекулярных механизмов межклеточного транспорта в растениях и его роли в вирусном и бактериальном патогенезе, исследовано возможное участие гена под рабочим названием G05, гомологичного гену, кодирующим в N. tabacum non-cell-autonomous pathway protein (NCAPP) и гену мутаротазы в контроле межклеточного транспорта сахаров и вирусов.По результатам проведенной в 2016 г. сделано следующее заключение: Ген G05 N. benthamiana, чувствительный к экзогенному метанола в физиологических концентрациях, имеет высокую гомологию с мутаротазой (альдоза 1-эпимераза) пасленовых. В растениях N. benthamiana с подавленным содержанием в листьях мРНК G05 также снижается содержание глюкозы в sink-листьях. Предполагается участие гена G05 в транспорте сахаров и других фотоассимилятов из листьев-доноров углерода (source листья) в растущие зоны растения N. benthamiana (sink-листья). Ген G05 участвует в репродукции ВТМ. 3. Продолжено исследование антистрессовых программ клеток млекопитающих, зависящих от онкосупрессора р53, центрального регулятора клеточного ответа на генотоксический стресс, и транскрипционного фактора ATF4, ключевого регулятора интегрального антистрессового ответа. Показано, что активация р53 негативно регулирует экспрессию ATF4, индуцированную не только при митохондриальной дисфункции, но и при стрессе эндоплазматического ретикулума. 4. Продолжено исследование танкиразы 2, фермента, катализирующего поли-ADP-рибозилирование белков, экспрессия которого повышена в опухолевых клетках, и активность которого может увеличиваться под влиянием стрессовых воздействий. Обнаружена активация танкиразы в почках после экспериментальной ишемии одного из двух парных органов подопытных животных. Увеличение ферментативной активности является ответом организма на указанный вид стресса и наблюдается в обеих почках независимо от того, какой из двух органов был лишен кровоснабжения. Сделан вывод, что активация танкиразы представляет собой общий ответ организма на некоторые виды стрессов.
5 2 января 2017 г.-29 декабря 2017 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа: 1. Изучение апоптотической протеазы растений. Установлено, что фитаспазы различных растительных организмов способны гидролизовать и инактивировать пищеварительные пептидные гормоны человека и животных гастрин и холецистокинин. Выявлены виды растений, в которых уровень активности фитаспаз особенно высок. Из этих растений выделены и идентифицированы новые фитаспазы. 2. Исследование биохимической природы и функции внутриклеточных форм ФАНЛ (NbKPILP), синтезируемых в клетках здорового и инфицированного листа. При изучении транскриптома листьев N. benthamiana, инфицированных вирусом мозаики табака, обнаружено накопление мРНК, кодирующей фактор, ассоциированным с некрозом листьев (ФАНЛ) или Kunitz Peptidase Inhibitor (KPI)-подобный белок (NbKPILP). Субклеточное фракционирование корня показало присутствие NbKPILP, главным образом, в мембранной фракции, что согласуется с присутствием в белке сигнальной последовательности. Вестерн-анализ белка корней выявляет набор полос NbKPILP-специфического белка, среди которых мажорная двойная полоса, соответствует белкам 30 и 29 кДа, что значительно превышает оценочный вес зрелого NbKPILP. При использовании сервера (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) нами предсказано, что NbKPILP в клетке подвергается гликозилированию (N-связанные гликаны в положениях Asn-60, Asn-86 и Asn-136). Проведенный нами масс-спектроскопический анализ изолированного из корней NbKPILP выявил присутствие углеводных остатков, что подтверждает его гликопротеиовую природу. Содержание NbKPILP и его мРНК в листьях резко увеличивается при стрессовом воздействии (например, при вирусной или бактериальной инфекции). При вирусной инфекции NbKPILP выявляется, главным образом, в клеточной стенке листьев и локализуется совместно с транспортным белком ВТМ, что предсказывает его участие в контроле функции плазмодесмы. Наши эксперименты указывает на участие NbKPILP в повышении пропускной способности межклеточного транспорта макромолекул в условиях абиотического и биотического стресса. 3. Механизмы функционирования опухолевого супрессора р53 при стрессовых воздействиях на клетку. Выявлено усиление экспрессии обнаруженных нами новых генов интегрального антистрессового ответа KRT16, FAM129A и HKDC1 при снижении активности опухолевого супрессора р53 в культуре клеток человека. Это служит подтверждением негативной регуляции интегрального антистрессового ответа при активации р53.
6 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа: 1. Изучение апоптотической протеазы растений. Изучена взаимосвязи между процессами аутофагии и программированной клеточной смерти у растений. 2. Генетические и химические основы коммуникации в растительном сообществе. Исследованы механизмы экспрессии фактора, ассоциированным с некрозом листьев (ФАНЛ), и альтернативной внутренней малой открытой рамки считывания (вмОРС). 3. Механизмы функционирования опухолевого супрессора р53 при стрессовых воздействиях на клетку. Идентифицированы новые гены, дифференциально регулируемые при активации р53 и индукции интегрального антистрессового ответа, опосредованного транскрипционным фактором ATF4. Опубликовано 9 научных статей в журналах, индексируемых Web of Science и Scopus.
7 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа: 1. Выявлены механизмы контроля IgA ответа при диете, содержащей повышенное содержание глюкозы, и протестированы моноклональные IgA для лечения заболеваний ЖКТ. Установлено более низкое содержание иммунных клеток костного мозга и селезенки у голого землекопа по сравнению с мышью, при этом относительная представленность популяции миелоидных клеток в этих органах была выше у голого землекопа. Разработаны методы для получения первичных культур различных типов иммунных клеток голого землекопа. 2. Показано, что последовательность, расположенная в кодирующей области гена ADM2 адреномедуллина человека на расстоянии 30 нт от старта трансляции, отвечает за связывание и регуляцию активности гена ADM2 транскрипционным фактором ATF4 при индукции интегрального антистрессового ответа. 3. Апоптотическая протеаза растений фитаспаза ре-импортируется в клетку при индукции программированной клеточной смерти. Показано, что механизмом ретроградного транспорта фитаспазы является клатрин-зависимый эндоцитоз. Обнаруженный нами механизм доставки протеазы в клетку не был выявлен ранее ни для одной растительной протеазы. 4. Установлено, что N-концевой сигнальный пептид белка KPILP (ФАНЛ) ответствен за доставку белка в клеточную стенку. Показано, что белок KPILP ко-локализуется с маркером плазмодесм транспортным белком ВТМ. N-терминальные 99 аминокислот белка KPILP содержат сигнал локализации в плазмодесме. KPILP взаимодействует с плазмодесмой и увеличивает ее апертуру. Процесс N-гликозилирования белка KPILP при его внутриклеточном транспорте к плазмодесме через мембранный аппарат Гольджи необходим для сохранения его способности «открывать» плазмодесмы. Опубликовано 9 научных статей в журналах, индексируемых Web of Science и Scopus. Представлены 4 доклада на научных конференциях. Защищена 1 кандидатская диссертация.
8 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа: По результатам проведенной в 2020 г. работы можно заключить следующее: 1. Охарактеризованы механизмы контроля микробиоты иммунной системой мыши. Исследована роль TNF для понимания механизмов индукции аутоиммунитета. Проведен анализ свойств первичных культур различных типов иммунных клеток голого землекопа. 2. Показано, что ATF4-зависимая регуляция промотора гена SESN2 опосредована последовательностью TTTTCATCA, расположенной на расстоянии 221 п.о. от старта транскрипции SESN2. Показано, что сайт связывания ATF4 в положении -138 промотора SESN2 также принимает некоторое участие в регуляции промотора SESN2, однако играет второстепенную роль. 3. Апоптотическая протеаза растений фитаспаза ре-импортируется в клетку при индукции программированной клеточной смерти. Показано, что импортированная в клетку фитаспаза частично ко-локализуется с ранними эндосомами. В стрессированных клетках растений также обнаружено образование необычных внутриклеточных структур (фитосом), содержащих фитаспазу и маркер поздних эндосом белок ARA7. Эти структуры по размеру значительно превышают обычные мультивезикулярные тела (поздние эндосомы). 4. Установлено, что природный субоптимальный нуклеотидный контекст стартового кодона основной ОРС NbKPILP является одной из причин низкого уровня накопления мРНК NbKPILP в интактном листе. Присутствие трансмембранного домена и остатков цистеина являются ключевыми особенностями кодируемого аОРС 53-ак пептида, которые негативно влияют на накопление мРНК NbKPILP. Свойства генов матрешек, сходных по организации с NbKPILP, не уникальны, а являются частью механизма регуляции «молчащих» генов. Анализ транскриптомов модельных растений, таких как табак и арабидопсис, предоставляют примеры предполагаемых генов-матрешек, которые «молчат» в листьях.
9 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа: 1. Выяснено несколько механизмов того, как вирус Sars-CoV-2 ингибирует иммунную систему организма и приводит к тяжелому течению заболевания. Установлена роль микобиоты в патогенезе ряда болезней у людей. Описаны особенности поляризации макрофагов голого землекопа. 2. Выявлены белки, взаимодействующие с апоптотической протеазой растений – фитаспазой. Показано, что белок-резидент эндоплазматического ретикулума кальретикулин-3 является не только партнером, но и субстратом фитаспазы. 3. Установлено, что транспортный белок (ТБ) ВТМ вызывает повышенное накопление в клетке мРНК белка KPILP, причем способность ТБ связываться с мембранами эндоплазматического ретикулума необходима для прямого или косвенного воздействия ТБ на мРНК KPILP. Показано, что индуцируемый в ответ на вирусную инфекцию KPILP сдерживает межклеточный транспорт вируса, причем проявление этой функции не зависит от наличия в KPILP сайтов N-гликозилирования.
10 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа: 1. У голого землекопа значительно увеличено количество лимфоцитов собственной пластинки кишечника на грамм ткани кишечника по сравнению с мышью. В М1 макрофагах голого землекопа слабо выражена фрагментация митохондрий. 2. Выяснена роль Aco2 - IgA кросс-реактивного взаимодействия в регуляции гипотермии. 3. При диете с высоким содержанием глюкозы выяснена роль TNF/TLR4 на миелодиных клетках и проанализирован вклад микробиоты в фенотип при высокоглюкозной диете. 4. Установлено, что пациенты с ревматоидным артритом нуждаются в трехдозовой вакцинации для индукции анти-Spike антител на слизистых оболочках. 5. Укороченный фитаспазой белок кальретикулин-3 (CRT3) табака перестает накапливаться в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). Как следствие, он подвергается фрагментации с образованием стабильного N-концевого лектинового домена белка. Образующийся N-концевой домен накапливается в апопласте. 6. В ряду исследованных растворимых белков-шаперонов ЭР табака лишь белок CRT3 является субстратом для фитаспазы. С другой стороны, способность фитаспазы инактивировать сигнал возвращения в ЭР белка CRT3 выявлена у растений разных видов, что свидетельствует в пользу универсальности данного механизма. 7. Установлено, что белок KPILP вовлечен в запуск и регуляцию системы передачи ретроградных сигналов от хлоропластов в ядро при вирусной инфекции, влияет на углеводный метаболизм и отток фотоассимилятов из source-листьев в точку роста. 8. Показано, что повышение экспрессии KPILP приводит к снижению отложений каллозы в районе плазмодесм и повышению их пропускной способности. Доказано, что KPILP необходим вирусу табачной мозаики для быстрого и эффективного заражения и является про-вирусным агентом: межклеточный транспорт и репродукция ВТМ в значительной степени подавлены в растениях с нокдауном эндогенного KPILP.
11 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа: По результатам проведенной в 2023 г. работы можно заключить следующее: 1. Появление Спайк-специфических антител после вакцинации ассоциировано с ростом комменсальной бактерии S. salivarius. Установлено, что антитела специфически распознают белок RSSL-1370 S. salivarius за счет молекулярной мимикрии. Дополнительное введение пробиотика S. salivarius К12 приводит к увеличению титра антител к SARS-CoV-2, усиливая защитный ответ. 2. Макрофаги костного мозга голого землекопа, активированные в воспалительных условиях (М1), увеличивают экспрессию провоспалительных генов, продукцию цитокинов и аэробный гликолиз, но в то же время способны лучше поддерживать функциональную активность митохондрий по сравнению с макрофагами мыши. М1 макрофаги голого землекопа не продуцируют оксид азота, что может отражать адаптацию иммунной системы к гипоксии в тканях голого землекопа. 3. Процессинг укороченного фитаспазой белка кальретикулина-3 (CRT3) с образованием стабильного N-концевого домена происходит внутри растительной клетки после перемещения белка в пост-эндоплазматический ретикулум (ЭР) компартмент. Образующийся в результате N-концевой домен CRT3 затем секретируется в апопласт. 4. Белок-шаперон CRT3 необходим для индуцированного стрессом ретроградного транспорта фитаспазы. 5. Идентифицировано 4 представителя семейства обратимо гликозилируемых полипептидов N. benthamiana. Уровень накопления мРНК всех NbRGP повышается в листьях в ответ на системную инфекцию ВТМ. При этом NbRGP1-3 играют роль факторов, сдерживающих развитие вирусной инфекции и распространение вируса по растению. Предполагаемый механизм противовирусного действия NbRGP заключается в блокировании межклеточного транспорта вируса: во-первых, через каллоза-опосредованный путь, во-вторых, путем взаимодействия с транспортным белком вируса, приводящего к нарушению его способности осуществлять транспортную функцию.
12 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа:
13 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Молекулярные механизмы ответа клеток на стрессовые воздействия
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".