ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ФНКЦ РР |
||
Структурно-функциональный анализ фоторецепторных молекул жгутиковых вородорослей, обладающих уникальными свойствами светоактивируемых ионных каналов, и разработка на их основе молекулярных оптогенетических агентов для нейрофизиологических и потенциально терапевтических приложений.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
14 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Фототаксис микроорганизмов |
Результаты этапа: Ранее путем исследования генетических трансформантов с повышенным содержанием одного из каналородопсинов мы показали, что каналородопсин 1 (КР1) модельного организма C. reinhardtii отвечает преимущественно за генерацию быстрого трансмембранного фототока с высоким уровнем светового насыщения, а каналородопсин 2 (КР2) - медленного, с низким насыщением, который отражает активацию вторичных кальциевых каналов в плазмалемме. Однако оставалось неясным, полностью ли разделены эти фунцкии, или они частично пересекаются. Недавно в другой лаборатории методом инсерционного мутагенеза был получен штамм-нокаут (нулевой мутант) КР1-гена, что дало нам возможность провести анализ фотоиндуцированных токов, генерируемых КР2, в отсутствие какого бы то ни было вклада со стороны КР1. В отчетном году мы провели сравнительный анализ экспрессии генов у нокаута (нулевого мутанта) по КР1 хламидомонады и ее дикого типа методом РНК-секвенирования (RNA-Seq). Полученные данные подтвердили, что штамм-нокаут практически не содержит КР1-мРНК, соответствующей участку гена ниже сайта вставки. Однако содержание мРНК гипотетических кальциевых каналов в клетках оказалось слишком низким для того, чтобы можно было идентифицировать гены тех из них, транскрипция которых могла бы быть нарушена у нокаута по сравнению с диким типом. Наше исследование спектральной зависимости быстрого компонента тока у нокаута в отчетном году, показало, что он также генерируется КР2, как и замедленный компонент. Более того, эксперименты по удалению ионов кальция из среды выявили, что у КР2 фунцкия прамой канальной активности конкурирует с фунцкией активации вторичных кальциевых каналов: когда концентрация в среде Ca2+ снижается, КР2 уже не может эффективно активировать воричные каналы, и его активность становится более похожей на ту, какую он проявляет в модельных клетках животных. Для исследования фунцкии КР1 в отсутствие соответствующего нокаута мы использовали возбуждение дикого типа длинноволновым светом, который КР2 практически не поглощает. Световая кривая, измеренная в таких условиях, не содержит компоненты насыщения при низких интенсивностях, что указывает на то, что этот компонент генерируется исключительно КР2. Хотя удаление из среды Ca2+ также приводит к снижению амплитуды токов, опосредованных КР1, дифференциальные сигналы, полученные вычитанием сигналов при низком Ca2+ из сигналов при высоком, не имеют лаг-периода, в отличие от сигналов, измеренных на КР1-нокауте. Таким образом, можно сделать заключение, что КР1 не участвует в активации вторичных каналов у водорослей, или, по крайней мере, степень его участия намного меньше, чем у КР2. В процессе исследования механизмов внутримолекулярного переноса протонов мы обнаружили, что у некоторых низкоэффективных каналородопсинов мутации, нейтрализующие отрицательный заряд карбоксильных групп аминокислотных остатков, образующих комплексный противоион Шиффова основания (гомологов Асп-85 и Асп-212 бактериородопсина), вызывают не длинноволновый спектральный сдвиг, как у большинства ранее исследованных ретинальных белков, а коротковолновый. Эти низкоэффективные каналородопсины не содержат остатка лизина во второй трансмембранной спирали, имеющегося у высокоэффективных каналородопсинов и соответствующего Лиз-132 химерного каналородопсина, кристаллическая структура которого была разрешена. Путем измерения спектров действия фотоиндуцированных канальных токов в культуре модельных клеток HEK293 и абсорбционной спектроскопии выделенных пигментов мы показали, что у исследованных каналородопсинов гомолог Лиз-132 контролирует направление спектрального сдвига, вызываемого мутациами карбоксильных остатков активного центра. Анализ двойных мутантов каналородопсинов показал, что наличие этого лизина у пигмента дикого типа или его добавление в результате мутагенеза приводит к длинноволновому спектральному сдвигу, а замещение его нейтральным остатком приводит к сдвигу в коротковолновую область. Нейтрализация самого этого остатка у высокоэффективных каналородопсинов также вызывает длинноволновый сдвиг, а его добавление в структуру низкоэффективного каналородопсина из водоросли Chlamydomonas augustae (CaChR1) вызывает коротковолновый сдвиг. Принимая во внимание то, что эффективный заряд карбоксильных групп аминокислот - ключевой фактор регуляции спектральных свойств родопсинов, эти результаты свидетельствуют, что гомолог Лиз-132 модулирует pKa этих групп. С другой стороны, мы установили, что мутации гомолога Арг-82, который играет эту роль в молекуле бактериородопсина, практически не влияют на спектральные свойства исследованных каналородопсинов. Титрование показало, что pKa гомолога Асп-85 у CaChR1 находится в щелочной области, в отличие от большинства ранее изученных родопсинов, но существенно снижается после добавления гомолога Лиз-132 или нейтрализации гомолога Асп-212. Кроме того, мы обнаружили, что у всех исследованных каналородопсинов гомолог Лиз-132 регулирует кинетику открывания и закрывания канала. Фотоактивация аттрактантного рецептора при фототаксисе Halobacterium salinarum, сенсорного родопсина I (SRI), предполагает перенос протона от Шиффова основания на акцептор в цитоплазматическом полуканале. На основании исследований переноса протона и двигательных реакций клеток в качестве кандидата на эту роль был предложен остаток Хис-166, однако прямые доказательства отсутствовали. В отчетном году мы подтвердили, при помощи дифференциальной инфракрасной Фурье-спектроскопии в комбинации с мутагенезом и изотопным замещением, что этот остаток действительно является акцептором протона Шиффова основания в фотоцикле, претерпеваемом SRI в комплексе с его трансдьюсером. В недавнем проекте по секвенированию транскриптомов водорослей, выполненном генетическим консорциумом, было идентифицировано несколько десятков новых последовательностей каналородопсинов. Интересно, что у некоторых видов водорослей было обнаружено две или даже три таких последовательности на геном. Как было показано ранее нами и другими исследователями, два каналородопсина модельного организма Chlamydomonas reinhardtii проявляют разные свойства как в нативных клетках, так и при гетерологической экспрессии в культуре клеток животных. В отчетном году мы начали сравнительный анализ канальной фунцкии еще четырех пар каналородопсинов, идентифицированных в геномах четырех видов водорослей, в модельной системе (культуре клеток НЕК293) и показали, что такие свойства, как более быстрая кинетика тока и зависимость максимума поглощения от рН, отличающие КР1 от КР2 у водоросли C. reinhardtii, не характерны для других пар каналородопсинов, выделенных из одного и того же организма. В процессе этой работы также выяснилось, что одна из опубликованных последовательностей каналородопсинов водоросли Platymonas subcordiformis, считавшаяся нефункциональной, содержала ошибку, устранение которой путем клонирования соответствующей кДНК позволило нам исследовать генерируемые ею фототоки. | ||
15 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Фототаксис микроорганизмов |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".