| Результаты этапа: Разработан способ получения биопленок для модельных клинически значимых микроорганизмов Kocuria и Pseudomonas с использованием в качестве носителей полистирольных планшетов или тефлоновых блочков. Этот метод позволяет изучать динамику формирования биопленок и действие на них биоцидных факторов.
Установлено, что формирование биопленок (переход к «биопленочному фенотипу») начинается в период 2-4 ч инкубации планктонных культур изучаемых бактерий в присутствии поверхности раздела фаз. В этот период времени (до 4 ч) культуры сохраняют высокую чувствительность к ингибитору белкового синтеза (азитромицину), характерную для планктонных культур. Внесение октакатионного фталоцианина «Холосенс» в концентрациях до 5 мкг/мл в суспензию планктонных культур существенно не влияет на последующую динамику формирования биопленок изучаемыми бактериями. Получены данные о действующих концентрациях Холосенс в составе растворов и гелей на рост биопленок.
Измерена сравнительная чувствительность планктонных культур и биопленок модельных клинически значимых штаммов Kocuria sp и P. сlororaphis к облучению (фотодинамическому воздействию) в присутствии в качестве фотосенсибилизатора октакатионного фталоцианина цинка - Холосенс. Показано что биопленки более чувствительны к облучению, чем планктонные культуры, а грамотрицательные бактерии устойчивее к такому воздействию, чем грамположительные.
Разработан метод получения биопленок на мембранных фильтрах, моделирующий ситуацию, возникающую при инфицировании бактериями открытых ран. Показано, что облучение в присутствии фталоцианина в концентрации 25-50 мкг/мл в виде раствора не только тормозит дальнейший рост предобразованных биопленок, но и вызывает их значительную деградацию. При концентрации фотосенсибилизатора в геле 50 мкг/мл в случае обоих изученных микроорганизмов происходить блокирование роста биопленки и ее полная деградация.
Получены данные об эффективности применения фталоцианинов в фотодинамической инактивации биопленок с различным видовым составом микроорганизмов. Показано, что в смешанной биопленке устойчивость культур к облучению не суммируется, а устойчивость смешанной биопленки соответствует устойчивости наименее чувствительного микроорганизма, в условиях проведенного эксперимента со смешанными биопленками грамположительных и грамотрицательных бактерий. После фотодинамического воздействия происходит сдвиг видового состава биопленки в сторону наименее чувствительного микроорганизма.
При исследовании влияния фотодинамического воздействия на ультраструктуру биопленок обнаружено, что облучение в присутствии красителя подавляет способность клеток к формированию полимерного матрикса биопленок, который обеспечивает защиту бактериальных клеток в составе биопленки к стрессовым воздействиям, антибиотикам, биоцидам.
Отработаны режимы применения препаратов фотосенсибилизаторов на основе фталоцианинов для инактивации биопленок. Для подавления роста биопленок грамположительных бактерий: фотосенсибилизатор - Холосенс в концентрации 10 мкг/мл в форме раствора, время инкубации – 20-30 мин, облучение белым светом в дозе 45-60 Дж/см2; для подавления роста смешанных биопленок грамположительных и грамотрицательных бактерий: фотосенсибилизатор - Холосенс в концентрации 25 мкг/мл в форме раствора или 50 мкг/мл в форме геля, время инкубации – 20-30 мин, облучение белым светом в дозе 60 Дж/см2; для деградации биопленок грамположительных бактерий: фотосенсибилизатор - Холосенс в концентрации 25-50 мкг/мл в форме раствора или 50 мкг/мл в форме геля, время инкубации – 20-30 мин, облучение белым светом в дозе 60 Дж/см2.
|
