ИСТИНА

Митохондрии изначально рассматривались как «микроэлектростанции», функция которых сводится к обеспечению клетки энергией в виде АТФ. Многие годы они были предметом изучения относительно узкой группы специалистов-биоэнергетиков. Однако около 20 лет назад было обнаружено, что эти органеллы также обладают рядом иных, жизненно важных и уникальных функций. Стало ясно, что именно митохондрии обеспечивают генерацию критических сигналов для клеточной пролиферации, дифференцировки, гибели или наоборот, выживания клетки после поступления сигнала на смерть. Они играют центральную роль в таких процессах, как апоптоз, некроз, воспаление, реакция на стресс, поддержание клеточности органов, а также в широком спектре патологий (инсульты, инфаркты, диабет, почечная недостаточность и др.) Кроме того, состояние митохондрий имеет огромное значение для проявления возрастной деградации и дисфункции органов и систем, определяющих нормальное или преждевременное старение организма. Важнейшим фактором, опосредующим эти явления, оказались генерируемые митохондриями активные формы кислорода (мАФК). Эти открытия вызвали резкий рост интереса ученых к митохондриям, и на настоящий момент их изучение – одно из основных направлений биологии во всем мире. Основное слабое место сотен научных групп, работающих по данной теме, заключается в отсутствии старой, классической школы митохондриологии, сочетающей в себе знание как основ биоэнергетики, так и структурно-функциональных особенностей митохондрий. Большинство современных исследователей перешли к изучению митохондрий из молекулярной и клеточной биологии, а также медицины, и не имеют должного «митохондриологического» образования. Следствием этого является, как правило, узкая специализация и сфокусированность каждой лаборатории на лишь одном из многочисленных аспектов митохондриальных функций. Важным преимуществом коллектива настоящего проекта является сочетание многолетнего опыта и знаний, как в области классической биоэнергетики, так и в области физико-химической, молекулярной и клеточной биологии митохондрий, а также владения широким спектром современных методов изучения митохондрий, от молекулярного до организменного уровня. В данном проекте собраны научные силы с самым высоким уровнем экспертизы не только в России, но в мире (что подтверждается импакт-фактором публикаций и рекордным для России цитированием членов проекта; см. приложенный материал). Проект направлен на прояснение роли митохондрий в молекулярных механизмах, определяющих судьбу живой клетки и организма. Планируется разработка широкого спектра новых методов изучения митохондрий, от молекулярного моделирования с применением самых мощных суперпкомпьютеров МГУ им. М.В.Ломоносова, до опытов на целом организме по предотвращению патологических изменений и запрограммированной гибели организма – феноптоза (термин предложен и введен в употребление в международном научном сообществе руководителем проекта). В результате работ по проекту будут разработаны новые инструменты для изучения структуры и функции митохондрий, в первую очередь – митохондриально-направленные соединения. Специфическая адресованность этих агентов обуславливается наличием в них положительного заряда, экранированного от гидратации группами-заместителями. Благодаря этим свойствам, данные катионы накапливаются в митохондриях, отрицательно заряженных относительно цитозоля, в многократном избытке. Первые подобные соединения были описаны руководителем проекта и вошли в науку как «ионы Скулачева», после того как им и его коллегами было открыто явление митохондриального лектричества (генерации разности электрического потенциала между матриксом митохондрий и цитозолем). Свойства новых соединений, синтезированных в ходе проекта, будут изучены как на модельных искусственных мембранных системах, так и на изолированных митохондриях животных и дрожжей. С помощью этих соединений будут решаться следующие задачи: 1) Выяснение молекулярных механизмов и путей регуляции избирательной деградации митохондрий (митофагии и митоптоза) при окислительном стрессе. Эта задача является актуальной, т.к. основная часть митохондриальных активных форм кислорода (мАФК) может продуцироваться небольшой фракцией дефектных митохондрий, и малоизученный процесс их избирательного элиминирования может играть важную роль при выборе клетки между жизнью и смертью. 2) Прояснение деталей механизмов эндогенных адаптивных клеточных сигнальных каскадов, направленных на защиту клетки от окислительного повреждения и идущих с участием митохондрий с акцентом на нейрологические патологии (ишемия и травма мозга, модели болезни Альцгеймера) 3) Изучение функционирования митохондрий животных в их естественном окружении, то есть без их выделения из клетки; расшифровка эндогенных сигнальных системы защиты клетки, в которых задействованы митохондрии, в частности – системы антиишемической защиты. 4) Поиск естественных регуляторов энергетической функции митохондрий методом генетического скрининга на одноклеточных эукариотах. По результатам скрининга с помощью геномного анализа будут найдены гомологи таких естественных регуляторов у млекопитающих и изучена их функция. 5) Разработка модели запрограммированной гибели организма, вызванной воздействием, которое само по себе не является смертельным. На этой модели будут детально сследованы изменения статуса митохондрий на всех стадиях патогенеза. По полученным в ходе проекта данным, а также по данным литературы, будет осуществлено математическое моделирование основных процессов митохондриального гомеостаза, в первую очередь, начальных стадий вызванной митохондриальными процессами запрограммированной клеточной гибели, и выяснение возможности контролированного фармакологического воздействия на эти процессы. Для этого предполагается сочетать теоретические методы биоинформатики, молекулярно-динамические симуляции и кинетическое моделирование (в том числе – с использованием суперкомпьютеров МГУ). Результаты работы проекта будут использованы для разработки новых методов профилактики и репарации окислительного повреждения митохондрий при помощи исследуемых соединений, в первую очередь – посредством регуляции уровня активных форм кислорода. Это является актуальнейшей задачей в области терапии патологий, имеющих митохондриальную природу. Важным аспектом предлагаемого проекта является передача практического опыта основных участников молодым исследователям, а также студентам, аспирантам и докторантам. Дополнительным преимуществом здесь является тесное сотрудничество коллектива проекта с факультетом биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В.Ломоносова. Большая часть коллектива проекта задействована в преподавании на факультете. Кроме того, с 2013 года часть студентов факультета имеет дополнительную образовательную программу по совершенно новой специальности «Митоинженерия», сфокусированной на изучении митохондрий. Предполагается, что эти студенты будут активно участвовать в данном проекте, в том числе в ходе выполнения курсовых и дипломных работ, а затем и кандидатских диссертаций, на указанном факультете, основателем и деканом которого является руководитель проекта.

В ходе работ по проекту в 2014 году был успешно синтезирован ряд новых митохондриально-адресованных соединеий. Так, присоединив децил-трифенил-фосфоний посредством сложноэфирной связи к флуоресцеину, был получен флуоресцентный зонд митофлуоресцеин, который способен накапливаться в энергизованных митохондриях. Было установлено, что митофлуоресцеин обладает протонофорной активностью и вызывает диссипацию мембранного потенциала, тем самым стимулируя дыхание митохондрий, т.е. проявляет свойства митохондриально-направленного разобщителя окислительного фосфорилирования. Новое соединение, сочетающее свойства флуоресцентного маркера и мягкого разобщителя, представляет большой интерес в области разработки лекарственных препаратов для лечения ожирения и различных заболеваний, связанных с окислительным стрессом. Также был получен ряд новых данных о механизме митофагии и митоптоза. Проверка клеточных моделей окислительного стресса для изучения механизмов митофагии и митоптоза включала: (1) снижение содержания глутатиона с помощью ингибитора гамма-глутамилцистеин синтазы; (2) культивация клеток в среде лишенной сыворотки; (3) частичная гипоксия (1,5% кислорода). Во всех этих моделях наблюдался окислительный стресс, который снижался в присутствии 20 нМ SkQ1, что указывало на ведущую роль митохондриальной продукции активных форм кислорода (АФК). Во всех этих моделях наблюдалось значительное усиление общей аутофагии, но не селективной митофагии. Максимальную стимуляцию аутофагии и одновременное массовое повреждение митохондрий (падение потенциала, фрагментация) индуцировали с помощью разобщителей окислительного фосфорилирования. Было установлено, что длительная (в течение 3 дней) инкубация клеток HeLa, Rko и A549 с разобщителями не приводила к выраженной митофагии, несмотря на высокий уровень неселективной аутофагии. В то же время, длительная инкубация клеток HeLa с разобщителем приводила к деградации митохондрий, предположительно, по механизму митоптоза. Было исследовано влияние функционального состояния митохондрий на аутофагию. Мы обнаружили, что ингибиторы III комплекса дыхательной цепи ингибируют аутофагию, тогда как другие ингибиторы дыхания ротенон (комплекс I) и цианид калия (комплекс IV) не влияли на содержание аутофагосом. Ранее было Проект № 14-24-00107/2014 Страница 14 из 54 показано, что ингибирование III комплекса может приводить к истощению пула пиримидинов, за счет снижения активности дегидрооротатдегидрогеназы, в результате чего в клетке активируется белок p53. Мы показали, что снижение экспрессии p53 с помощью РНК-интерференции не препятствовало действию ингибиторов III комплекса и, следовательно, данный белок не играет значительной роли в ингибировании аутофагии. Подавление аутофагии под действием ингибиторов III комплекса можно объяснить нарушением биосинтеза фосфолипидов, который зависит от цитидина. Мы подтвердили это предположение показав, что добавление цитидина или предшественника фосфолипидов ЦДФ-холина предотвращали действие ингибиторов III комплекса на аутофагию. Игибиторы III комплекса стимулировали деградацию митохондрий, вызванную разобщителями. Это позволяет предполагать, что ингибирование аутофагии способствует активации альтернативного механизма деградации митохондрий - митоптоза. Исследовалось протонофорное действие коньюгатов трифенилфосфония в присутствии пальмитиновой кислоты. Измерялся трансмембранный диффузионный потенциал, индуцированный градиентом рН в одну единицу в присутствии жирной кислоты. Была охарактеризована рН зависимость протонофорного эффекта пальмитиновой кислоты в присутствии катионов C12-TPP, максимальное протонофорное действие достигалось при рН>6. Также была изучена индукция тока на БЛМ под действием митофлуоресцеина (mitoFluo) и рН зависимость действия mitoFluo на БЛМ. Было установлено, что эта рН зависимость имеет максимум при рН 3. Окисление линолевой кислоты кардиолипина является ключевой реакцией инициации митохондриального апоптоза, низкомолекулярные соединения (в том числе АФК), ускоряющие этот процесс, являются прооксидантами, блокирующие - антиоксидантами. Для экспериментального изучения взаимодействия кардиолипина с редокс-активными соединениями, обладающими антиоксидантым или прооксидантным эффектом, а также с цитохромом с, был разработан метод получения липосом из кардиолипина сердца быка. В этой модельной системе проводилась регистрация образования продуктов перекисного окисления, а также измерялось количество прореагировавшего эффектора. С помощью данной модельной системы было исследовано антиоксидантное и прооксидантное действие ряда соединений хинонной природы – производных убихинона, платостохинона, альфа-токоферола, а также ионов SkQ1 и водорастворимой формы альфа- токоферола. Было показано, что прооксидантной активностью обладают только производные пластохинона. Пластохинон и убихинон обладают примерно одинаковой антиоксидантной активностью, которая примерно в шесть раз выше антиоксидантной активности альфа-токоферола. Для проверки ранее высказанной гипотезы, согласно которой изменение конформации bc1-комплекса в результате окисления кардиолипина в сайтах его связывания является триггером митохондриальной формы апоптоза, была разработана молекулярно-динамическая модель bc1-комплекса в митохондриальной мембране. Модель включала липидный бислой, встроенный в него димер цитохромного bc1-комплекса, связанный с кардиолипином водорастворимый цитохром с, низкомолекулярные соединения митохондриальных эффекторов и антиоксидантов. Были смоделированы аллостерические изменения конформации bc1-комплекса, вызванные связыванием производных TTP в периферийном сайте кардиолипина и в сайте связывания хинона Qi. Связывание TTP в переферийном центре сопровождалось существенными конформационными изменениями всего bc1-комплекса, что может иметь регуляторное значение. Была составлена минимальная кинетическая модель основных метаболических процессов инициации апоптоза и найдены интервалы возможных значений констант реакций, определяющих кинетическую эффективность каждого блока модели. В итоге была построена математическая модель регуляции перекисного окисления кардиолпина в митохондриальной мембране, были разработаны методы анализа фазового пространства системы дифференциальных уравнений и алгоритмы их численного интегрирования. В результате работы мы также экспериментально показали и логически доказали, что патологии клеток и тканей, сопровождающиеся окислительным стрессом, как на клеточном, так и надклеточном (тканевом или имитирующим тканевой) и организменных уровнях определяются митохондриальными АФК, для которых существует порог для перехода их действия в условия возникновения патологии, часто заканчивающиеся гибелью организма. Этот порог оказался очень индивидуальным для разных митохондрий, существующих в клеточной популяции, что позволило сформулировать понятие «митобиоты» (по аналогии с понятием «микробиоты»), гомеостаз которой очень важен для недопущения перехода клетки в патологическое состояние. При этом одним из инструментов сохранение митохондриального гомеостаза является поддержание митохондриальных АФК на низком уровне, обеспечивающем лишь необходимую внутриклеточную сигнализацию. Нам удалось расширить список веществ – так называемых «мягких разобщителей», среди которых можно найти агенты, потенциально годные для терапии патологий мозга и почек (в частности сопряженных с ишемией), в том числе – вышеупомянутый митофлуоресцеин. Надо отметить, что механизм действия «мягких разобщителей» остается невыясненным и является предметов для дальнейших исследований. В качестве важного результата исследований, надо отметить факт доказательства участия воспалительного процесса в целом ряду тканевых патологий с доказанными важными компонентами врожденного иммунного ответа, такими, например, как активация толл-подобных рецепторов, в частности, при пиелонефрите. Мы делаем вывод о возможности патологического проявления воспалительного ответа, идущего с участием митохондрий, в результате чего возникает необходимость предотвращения гиперактивации иммунной системы, которую можно осуществить, в частности, за счет регуляции уровня внутримитохондриальных АФК. Учитывая сложность, а иногда и невозможность воспроизведения патологического процесса in vivo, нам пришлось разработать клеточные модели патологий. Уже полностью поставлена клеточная модель пиелонефрита и сейчас начата разработка in vitro моделей мозговых патологий, сопряженных с воспалением. Эти многокомпонентные модели основаны на сокультивации разных клеток и элементов клеток. Мы ожидаем, что сокультивация разных типов клеток в идеале даст возможность создания тканевой культуры, на которой возможно моделирование протекания патогенного процесса. На сегодняшний момент при частичной реконструкции модели воспалительного процесса в мозге и других органах (полная реконструкция потребует несколько лет работы) мы являемся в некотором плане пионерами таких исследований в мире. Важным результатом исследований является пока еще намек на создание модели программируемой организменной гибели (феноптоза острого или медленного). При кажущейся простоте септической гибели организма, оказывается, что механизм гибели многогранен и труден в выявлении причины. Понимая, что гибель организма при сепсисе может сопровождаться или не сопровождаться бактериальным заражением крови, мы остановились на второй возможности, когда гибель организма происходит вследствие циркуляции в крови элементов митохондрий и продуктов их распада. Мы получили первые положительные данные по постановке такой модели путем инъекции животным выделенных митохондрий из разных органов. Эти данные свидетельствуют об участии митохондрий и производимых ими АФК в гибельном процессе. Таким образом, мы получили дальнейшее подтверждение наиважнейшего участия митохондрий и производимых ими активных форм кислорода в большому ряду клеточных, органных и организменных патологий.