Биодеградируемые полимер-липидные наноконъюгаты для инкапсулирования лекарственных веществ и визуализации их внутриклеточной доставкиНИР

Biodegradable polymer-lipid nanoconjugates for drugs encapsulation and imaging of their intracellular delivery

Соисполнители НИР

НИЦ "Курчатовский институт" Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 14 июля 2014 г.-31 декабря 2014 г. Биодеградируемые полимер-липидные наноконъюгаты для инкапсулирования лекарственных веществ и визуализации их внутриклеточной доставки
Результаты этапа: План на год выполнен полностью
2 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Биодеградируемые полимер-липидные наноконъюгаты для инкапсулирования лекарственных веществ и визуализации их внутриклеточной доставки
Результаты этапа: План на 2015 год выполнен полностью
3 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Биодеградируемые полимер-липидные наноконъюгаты для инкапсулирования лекарственных веществ и визуализации их внутриклеточной доставки
Результаты этапа: Были получены «рН-градиентные» липосомы с буферным раствором с рН 3 внутри, внешний раствор представлял собой буфер с рН 7. Липосомы состояли из смеси электронейтрального фосфатидилхолина (ФХ) и анионного дифосфатидилглицерола (кардиолипина, КЛ2-) с мольной долей анионных КЛ2- «головок» 2[КЛ2-]/(2[КЛ2]+[ФХ]) = 0.1. Липосомы заполняли раствором противоопухолевого антибиотика доксорубцина (Докс), который в протонированной форме концентрировался внутри липосом. Для придания анионным ФХ/КЛ2- липосомам, нагруженным Докс (Докс-липосомам), аффинности к отрицательно заряженным полилактидным мицеллам на поверхности липосом адсорбировали катионный полимер, поли-N-этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭВП) или полилизин. В обоих типах модифицирующих комплексов, МОКО-1 и МОКО-2 (1)весь добавленный поликатион связан в комплекс с липосомами, (2) в обоих модифицирующих комплексах на одну липосому приходилось в среднем 4 цепи поликатиона и (3) частицы обоих комплексов несли небольшой положительный поверхностный заряд. Целостность ФХ/КЛ2- Докс-липосом в составе МОКО-1 и МOKO-2 контролировали методом флуоресценции. Нарушение целостности липосомальной мембраны, если таковое имеет место, должно сопровождаться вытеканием Докс во внешний раствор, уменьшением его концентрации и, как следствие, возрастанием суммарной интенсивности флуоресценции суспензии. В ходе проведенных нами экспериментов мы не наблюдали возгорания флуоресценции в течение трех часов после формирования обоих типов модифицирующих комплексов, МОКО-1 с ПЭВП и МОКО-2 с полилизином. Иными словами, целостность липосом после формирования МОКО-1 и МОКО-2 сохранялась. Водные растворы МОКО-1 и МОКО-2 с Докс-липосомами добавляли к мицеллярному раствору диблок-сополимера ПЛА64-ПЭГ113 в буфере с рН 7. За связыванием МОКО-1 и МОКО-2 с полилактидными мицеллами следили методами динамического светорассения и УФ-спектроскопии. Полученные результаты позволили оценить максимальное количество Докс-липосом, которое может связаться с одной полилактидной мицеллой: 5 для наноконъюгата МОКО-1/мицелла и 6 для наноконъюгата МОКО-2/мицелла. Приведенные выше данные по составу наноконъюгатов, включающих ФХ/КЛ2- липосомы с Докс, совпадают с результатами оценки состава наноконъюгатов, включающих ФХ/КЛ2- липосомы, не содержащие доксорубицина. Таким образом, заполнение внутреннего объема липосом противоопухолевым препаратом не влияло на способность липосом формировать модифицирующие комплексы с поликатионами и на способность модифицирующих комплексов связываться с полилактидными мицеллами. Исследование влияния температуры на целостность наноконъюгатов, содержащих липосомы с инкапсулированными веществами, представляет интерес с точки зрения выбора условий хранения наноконъюгатов и контроля их деградации (декструкции) после введения в организм. С этой целью были приготовлены наноконъюгаты МОКО-1/мицелла и МОКО-2/мицелла, заполненные растворами неорганической соли (NaCl) и доксорубицина. Формирование комплексов МОКО-1 и МОКО-2 с участием липосом, заполненных солью и лекарством, и связывание модифицирующих комплексов с полилактидными мицеллами (формирование наноконъюгатов) проводили при 20°С. Далее суспензии наноконъюгатов переносили в кюветы, которые термостатировали в течение трех часов при трех температурах: 4, 20 и 37 °С, с одновременным контролем электропроводности или флуоресценции суспензий. В ходе проведенных нами экспериментов мы не наблюдали изменения в электропроводности и интенсивности флуоресценции суспензий. Иными словами, трехчасовое выдерживание суспенизий наноконъюгатов при температуре 20 °С, а также охлаждение суспензий до 4 °С и их нагревание до 37 °С не отражалось на целостности включенных в них липосом. В наноконъюгатах с участием полилактидных мицелл, липосом и полилизина все компоненты являются биодеградируемыми, что позволяет рассчитывать на разрушение наноконъюгатов и их выведение из организма после выполнения ими транспортной функции. Мы провели сравнение скоростей процессов биодеструкции наноконъюгата МОКО-2/мицелла при трех разных температурах: 4, 20 и 37 °С. Биодеструкцию инициировали добавлением протеолитического комплекса Морикраза, представляющую собой смесь ферментов (сериновой протеиназы, коллагеназы, металлопротеиназы и т.д.), которые способны расщеплять сложноэфирные, пептидные и амидные связи. За процессом деструкции следили по изменению размера частиц в суспензии. В отсутствии Морикразы размеры наноконъюгатов практически не изменялись в течение недели, это наблюдение было справедливо для всех трех температур. Добавление Морикразы к суспензиям наноконъюгатов МОКО-2 и полилактидных мицелл вызывало постепенное уменьшение размера частиц в суспензии до 15 нм; тем самым решалась проблема выведения продуктов биодекструции из организма. Процесс биодеструкции развивался тем быстрее, чем выше была температура, при которой проводился эксперимент. При 4 °С 15 нм частицы появлялись лишь через 10 дней, при 20 °С через 6 дней, а при 37 °С уже через 4 дня. Следующим шагом было исследование кинетики высвобождения инкупсулированных в липосомах веществ в ходе биодеструкции наноконъюгатов МОКО-2/мицелла. Для этого были приготовлены три типа ФХ/КЛ2- липосом, заполненных (1) неорганической солью, (2) флуоресцентным красителем карбоксифлуоресцеином (КФ) и (3) противоопухолевым антибиотиком доксорубицином. ФХ/КЛ2- липосомы с наполнителями использовали для получения модифицирующиго комплекса МОКО-2 с полилизином и наноконъгата МОКО-2/мицелла ПЛА64-ПЭГ113. К наноконъюгатам с инкапсулированными веществами добавляли раствор протеолитического комплекса Морикраза, после чего смеси термостатировали при трех температурах: 4, 20 и 37 °С. Для липосом с разными наполнителями скорость высвобождения повышалась с температурой. При 4 °С высвобождение веществ начиналось через 5-7 часов и завершалось через 18-20 часов после добавления Морикразы; при 20 °С высвобождение начиналось через 3-5 часов и завершалось через 10 часов; при 37 °С заметное вытекание инкупсулированных веществ регистрировалось через 3 часа и завершалось через 5-6 часов после добавления Морикразы. Интересно сравнить скорости вытекания инкупсулировнных веществ со скоростями биодеструкции наноконъюгатов (последние оценивались по уменьшению размера частиц в системе): – для полного вытекания инкапсулированных веществ из липосом требовалось от 5-6 часов при 37 °С до18-20 часов при 4 °С. За это время размер частиц в системе практически не изменялся. На этом этапе ферменты, входящие в состав протеолитического комплекса Морикраза, атаковали в основном эфирные связи в липидных молекулах, что приводило к дестабилизации липидного бислоя и вытеканию веществ из липосом. Полилактидное ядро при этом не претерпевало серьезных изменений; – биоразрушение полилактидного ядра становилось заметным после того, как Морикраза разрушала липосомы и полилизин в адсорбированном комплексе МОКО-2, и этот процесс развивался тем быстрее, чем выше была температура, при которой проводился эксперимент; – во всех случаях биодеструкция приводила к полному (количественному) высвобождению веществ из липосом в окружающий раствор. Для оценки цитотоксичности конъюгатов и отдельных компонентов комплекса использовали МТТ тест, основанный на способности митохондриальных ферментов живых клеток конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий-бромид жёлтого цвета в пурпурный формазан. Использовали два типа опухолевых клеток: нормальные MCF-7 и резистентные MCF-7/ADR. Наноконъюгаты формировали из МОКО-2, в котором липосомы были заполнены доксорубицином, и мицелл диблок-сополимера ПЛА64-ПЭГ113. В качестве сравнения использовали наноконъюгаты, в которых для формирования МОКО-2 использовали липосомы, не содержавшие доксорубицина. Для обоих типов клеток, нормальных и резистентных, определяли концентрации наноконъюгатов, вызывавшие 50%-ную гибель клеток (LC50). Эти пороговые концентрации были приняты за цитотоксичность исследуемых комплексов. Оказалось, что для нормальных клеток наноконюгаты без лекарства были на порядок менее токсичны, чем заполненные лекарством наноконъюгаты. Одновременно этот результат свидетельствовал о том, что цитотоксичность Докс, определяющая его терапевтический эффект, сохранялась после инкапсулирования лекарства в липосомы. В случае резистентных клеток различие в цитотоксичности было не столь существенно; инкапсулирование Докс в липосомы не влияло на его токсичность по отношению к резистентным клеткам. В дополнение к этому была сделана оценка цитотоксичности продуктов биодеградации наноконъюгатов, полученных из МОКО-2 и мицелл диблок-сополимера ПЛА64-ПЭГ113. Исследование проводили на резистентных клетках MCF-7/ADR. Профили всех полученных кривых в координатах «доля выживших клеток – конценцентрация добавленного вещества» свидетельствовали о низкой цитотоксичности как исходного наноконъюгата, так и продуктов его деструкции на протяжении всего процесса биодеградации (до 87 часов включительно). Для визуализации взаимодействия наноконъюгатов МОКО-2/мицелла с клетками MCF-7 были использованы ФХ/КЛ2- липосомы, внутренний объем которых был заполнен доксорубицином. На флуоресцентном изображении исходный конъюгат был представлен красными частицами; их цвет определялся наличием инкапсулированного Докс, характеризующегося яркой флуоресценцией в красной части спектра. На микрофотографии клеток MCF-7 после инкубирования с наноконъюгатом, содержавшем Докс-липосомы, видна клетка с ярко прокрашенным ядром и слабо прокрашенной цитоплазмой. Этот результат отражает проникновение наноконъюгата в клетку с последующим высвобождением доксорубицина из липосом. Большая часть лекарства проникает в ядро, где встраивается в ДНК – основную мишень Докс в клетке, в то время как меньшая часть лекарства распределяется в цитоплазме. Принимая во внимание данные по биодеградации наноконъюгата в модельной системе, содержащей протеолитический комплекс Морикразу, можно ожидать разрушение конъюгата после введения в организм с последующим его удалением в виде наноразмерных частиц. Полученные результаты создают основу для развития мультилипосомального направления в инкапсулировании и доставке лекарственных веществ. С целью расширения круга липосом для получения мультилипосомальных комплексов была исследована целостность твердых липосомы с ограниченной подвижностью липидных молекул, состоящих из дипальмитоилфосфатидилхолина, кардиолипина и холестерина. Полученные трехкомпонентные липосомы, заполненные 1М раствором NaCl, сохраняли свою целостность в течение 3 часов после приготовления. При этом – что важно – фазовое состояние липосомальной продолжало оставаться твердым. Эти результаты говорят о том, что твердые анионные липосомы со встроенным холестерином могут быть использованы для формирования мультилипосомальных носителей водорастворимых лекарственных веществ.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".