Изучение состава метаболических профилей в биологических средах человека при критических состояниях. Поиск низкомолекулярных органических веществ - потенциальных биомаркеров сепсиса в образцах сыворотки крови человекаНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 18 марта 2013 г.-31 декабря 2013 г. Изучение состава метаболических профилей в биологических средах человека при критических состояниях. Поиск низкомолекулярных органических веществ - потенциальных биомаркеров сепсиса в образцах сыворотки крови человека
Результаты этапа: За первый год выполнения проекта удалось продвинуться в решении вопроса селективного извлечения целевых кислот из образцов сыворотки крови. Была выявлена причина, способствовавшая искажению результатов анализов, и найдены пути минимизации этого влияния. Более высококипящие компоненты анализируемых образцов, соизвлекаемые во время пробоподготовки (жидкость-жидкостной экстракции диэтиловым эфиром) вместе с целевыми соединениями, а также, возможно, их продукты разложения в хроматографической системе, загрязняли эту систему, источник ионизации и предфильтр масс-спектрометра. Это приводило к росту фонового сигнала, появлению мешающих пиков на хроматограммах, необходимости в разы увеличивать время хроматографического анализа, увеличивать время на контрольные опыты, приводило к увеличению предела обнаружения искомых веществ. Кроме того, в некоторых моделях масс-спектрометров это приводит к выходу из строя электронной платы обогревателя источника ионов. Экспериментально выявлено что, веществом, отражающим присутствие таких соединений в анализируемой смеси является холестерин, содержание которого в анализируемых пробах, обычно как минимум на порядок больше чем определяемых кислот. Уменьшение содержания данного компонента в анализируемой пробе явилось своеобразным сигналом, характеризующим правильность выбора условий пробоподготовки. Целью дальнейшего исследования было обеспечить снижение соизвлечения холестерина (и других высококипящих веществ) вместе с целевыми кислотами во время пробоподготовки с минимальными потерями последних. Для этой цели для извлечения маркёров сепсиса из образцов был выбран метод сорбционного концентрирования, который широко используется при анализе биологических матриц. Проблема была в том, какой сорбент выбрать для выполнения цели работы – селективного, максимально полного извлечения кислот с минимальным извлечением холестерина. В литературных данных не удалось найти такой сорбент. Не было данных как по одновременному извлечению всех шести кислот (полярность которых значительно отличается) из образцов, так и по их селективному извлечению по отношению к холестерину (сорбенты, использованные для кислот, подходили и для извлечения холестерина). На основании литературных данных по извлечению низкомолекулярных соединений из биологических матриц было принято решение использовать в качестве сорбента сверхсшитый полистирол, разработанный сотрудниками лаборатории ССП ИНЭОС под руководством профессора Даванкова В.А. и д.х.н. Цюрупы М.П. в начале 70-х гг. Использовали Purosep 270 (Purolite, Великобритания). Сорбент имеет поры диаметром 20-40 A, которые доступны низкомолекулярным веществам и не доступны таким крупным молекулам, как белки или полисахариды, а также широкие транспортные поры размером в несколько сотен A. Это различие лежит в основе анализа биологических жидкостей – например, определение содержания фармацевтических препаратов. Извлечённые аналиты дериватизировали и аликвоты полученных растворов анализировали методом ГХ-МС. Была значительно повышена селективность извлечения искомых кислот по отношению к холестерину.
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Изучение состава метаболических профилей в биологических средах человека при критических состояниях. Поиск низкомолекулярных органических веществ - потенциальных биомаркеров сепсиса в образцах сыворотки крови человека
Результаты этапа: В процессе исследования столкнулись с особенностями поведения пробы на сорбенте, не позволяющими на данный момент обеспечить воспроизводимые результаты по приемлемому (более 60-70%) совместному извлечению рассматриваемых кислот из образца. Для удаления мешающего влияния матрицы образцов сыворотки сорбент промывали различными растворителями, различными по значению объёмами водных и органических растворов. Проводили предваряющую сорбционному концентрированию очистку образцов от высокомолекулярных соединений. На основании полученных результатов конкретизированы пути решения задачи по уменьшению влияния матричного эффекта образцов сыворотки крови на воспроизводимое извлечение искомых компонентов с приемлемыми степенями извлечения. Параллельно изучается возможность применения метода сорбционного концентрировании аналитов образцов сыворотки крови на сорбентах малого объёма (Microextraction in packed syringe (MEPS)) для извлечения искомых соединений и других потенциальных маркёров для последующего ГХ-МС анализа. Были сопоставлены результаты анализа растворов производных искомых фенилкарбоновых кислот методами ГХ-ПИД и ГХ-МС и показана возможность применения метода ГХ-ПИД для обнаружения искомых веществ и сравнения образцов сыворотки здоровых волонтёров и при критических состояниях, вызванных сепсисом. Была также рассмотрена возможность анализа разбавленных образцов сыворотки крови напрямую методом высокоэффективной жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (с регистрацией отрицательных ионов) и масс-анализатором – тройным квадруполем (МС-МС режим). Были рассмотрены два варианта градиентного элюирования искомых кислот на колонке с обращённой фазой. Элюент ацетонитрил-муравьиная кислота-вода и элюент ацетонитрил-вода. В первом случае было достигнуто селективное и эффективное хроматографическое разделение искомых аналитов, но пределы детектирования были заметно ниже требуемых для практического применения. Причина - основной вклад незаряженных частиц во фрагментацию депротонированных аддуктов молекул ФКК с муравьиной кислотой (в масс-спектре вторичных ионов виден ион муравьиной кислоты, нейтральный фрагмент, содержащий информацию о молекулярной массе искомых веществ, не фрагментрируется). Во втором случае хроматографические пики были неправильной формы (размытые, с хвостами), что так же не позволило достичь требуемых пределов обнаружения. Для обнаружения дикарбоновых кислот и аминокислот в образцах использовали пробоподготовку, основанную на ацилировании этих веществ непосредственно в образце с последующей экстракцией продуктов органическим растворителем.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Изучение состава метаболических профилей в биологических средах человека при критических состояниях. Поиск низкомолекулярных органических веществ - потенциальных биомаркеров сепсиса в образцах сыворотки крови человека
Результаты этапа: Продолжены исследования по селективному определению фенилкарбоновых кислот ((2-фенилуксуной (ФУК), 3-фенилпропановой (ФПК), 3-фенилмолочной (ФМК), 2-(п-гидроксифенил)уксусной (ГФУК), 3-(п-гидроксифенил)пропановой (ГФПК) и 3-(п-гидроксифенил)молочной (ГФМК)) в сыворотке крови. Продолжены исследования в области условий дериватизации исследуемых кислот. Для упрощения пробоподготовки, с одновременным повышением воспроизводимости и сокращением времени на её проведение, без потерь в выходе реакции дериватизации, оптимизировали условия дериватизации непосредственно в экстракте (экстрагенты: метилтретбутиловый эфир, диэтиловый эфир). В стадии пробоподготовки, связанной с осаждением белков использовали ацетонитрил. Для полного (визуально полного) осаждения белков из 200 мкл сыворотки потребовалось более 200 мкл ацетонитрила. Пропускание надосадочной фракции (водный раствор ацетонитрила) через патрон с сорбентом (и после предварительного разбавления раствора) не позволил провести воспроизводимое сорбционное концентрирование искомых кислот. От осаждения белков органическими растворителями в дальнейших исследованиях отказались. Для осаждения белков так же использовали нитрат серебра и сульфат меди. Аликвоты 10%-ых растворов солей добавляли к 200 мкл сыворотки, центрифугировали, отбирали надосадочный слой, переносили в другую виалу и вновь добавляли раствор соли. Для полного осаждения белков было достаточно 100 мкл растворов солей. Для очистки образцов крови от белковой фракции применяли микропористые полиэфирсульфоновые мембранные фильтры (с размером пор 0.22 мкм). Потерь искомых кислот не наблюдалось, но и достаточной очистки от белковой фракции достичь не удалось. В направлении использования мембранных фильтров для пробоподготовки предполагается продолжить исследования. Исследование по извлечению ФК кислот с помощью микросорбционного концентрирования (сорбционного концентрировании аналитов образцов сыворотки крови на сорбентах малого объёма (Microextraction in packed syringe (MEPS)) продолжается. Результаты будут отражены в соответствующей публикации. Для извлечения исследуемых ФК кислот сравнили возможности сверхсшитого полистирола марки Purosep-270 и полимерных сорбентов SEPABEADS ® SP207SS (бромированный стирол-дивинилбензол) и DIAION ® HP2MG (полиметилметакрилат). Для SEPABEADS ® SP207SS и DIAION ® HP2MG стадию высушивания сорбента после сорбционного концентрирования и кондиционирования патронов с сорбентами пришлось исключить из-за требуемых больших затрат времени (до 40 мин) и, при этом, неполного высушивания сорбента (а для силилирования, в пробе не должно присутствовать даже остатков воды). Кислоты элюировали с сорбентов (без их высушивания) метилтретбутиловым эфиром, последовательно пятью аликвотами. В первой фракции содержались остатки воды и эфира, в последующих только эфир. Дериватизацию проводили в органической фазе (из первой фракции её предварительно отделяли от водной фазы). Проведенные эксперименты показали, что в случае DIAION ® HP2MG исследуемые соединения элюируются из сорбента в основном с первой фракцией (при этом извлекается не более половины попавшего в патрон количества вещества, даже если суммировать количества извлечённых веществ за все 5 стадий элюирования (для всех кислот)). Та же картина наблюдается для SEPABEADS ® SP207SS, но в этом случае степени извлечения не более 40%. Сверхсшитый полистирол, как показали наши исследования, позволяет селективно извлечь из раствора все 6 кислот со степенями извлечения не менее 50% (и до 80%). Форма частиц сверсшитого полистирола Purosep-270 заметного влияния на извлечение кислот из раствора не оказала. Применение метода ВЭЖХ/МС, на данном этапе исследования, не позволило достичь требуемых пределов обнаружения искомых кислот в сыворотке крови (не удалось достичь уровня содержания ФК кислот в образце сыворотки здоровых добровольцев). На момент написания отчёта для дальнейшей работы по селективному выделению фенилкарбоновых кислот ((2-фенилуксуной (ФУК), 3-фенилпропановой (ФПК), 3-фенилмолочной (ФМК), 2-(п-гидроксифенил)уксусной (ГФУК), 3-(п-гидроксифенил)пропановой (ГФПК) и 3-(п-гидроксифенил)молочной (ГФМК)) из сыворотки крови (и автоматизации этого процесса) выбрали методику эксперимента, объединяющую стадию осаждения белков сульфатом меди, сорбционное концентрирование ФК кислот на сверхсшитом полистироле, десорбцию кислот метилтретбутиловым (или диэтиловым) эфиром и их дериватизацию (силилирование) непосредственно в полученном растворе в эфире. Далее ГХ-МС анализ полученного раствора производных.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".