![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Цель и задача проекта заключается в том, чтобы исследовать возможности регуляции работы цитохром с оксидазы (ЦО) митохондрий через взаимодействие лигандов с консервативной амфипатической площадкой, расположенной вблизи устья протонного канала К. Группой Фергюсон-Миллер (Мичиганский университет) такая площадка была обнаружена в структуре субъединицы I бактериальной ЦО из Rhodobacter spaeroides и показано связывание с ней целого ряда детергентов, стероидов и родственных им соединений. В данном проекте предполагается провести исследования на цитохромоксидазе, выделенной из митохондрий сердца быка. Очевидно, что именно в митохондриях животных регуляторное взаимодействие со стероидами, тиреоидными гормонами и другими физиологически активными соединениями имеет особый смысл и должно быть наиболее актуально. Предлагаемое исследование преследует 2 основные задачи. Во-первых, выявить возможность прямой регуляции митохондриальной ЦО физиологически активными соединениями , включая стероидные и тиреоидные гормоны и структурно родственные им соединения.. Важность этой проблемы очевидна. Во-вторых, мы надеемся, что попутно удастся разрешить одну давнюю биохимическую загадку в энзимологии митохондриальной ЦО, известную почти с середины XX века. Известно, что некоторые детергенты, широко применявшиеся для выделения и очистки ЦО (например, Тритон X-100 или дезоксихолат) позволяют получить чистый однородный фермент, содержащий все субъединицы и простетические группы, однако, частично или практически полностью лишенный активности. Ингибирующее действие таких детергентов как Тритон Х-100 или дезоксихолат на активность ЦО может как раз объясняться их специфическим взаимодействием с амфипатической площадкой, контактирующей с каналом К, так что связывающийся лиганд стерически «пережимает» канал. Такой механизм действия может быть достаточно надежно проверен.
The aim of the project is to study the possibilities of regulation of mitochondrial cytochrome c oxidase (CcO) activity by interaction of ligands with a conserved amphipathic cavity near the entrance of proton channel K. Such a cavity accessible from the bulk aqueous phase has been discovered in the structure of catalytic subunit I of CcO from Rhodobacter sphaeroides by Fergusson-Miller group (Michigan State University) and was shown to bind various detergents, steroids and structurally related substances. In the current project we plan to study CcO isolated from mitochondria of bovine heart. It is obvious that regulatory effect of steroid and thyroid hormones and other physiologically active substances will make special sense and must be more actual. This study runs after two main goals. First, to reveal the possibility of direct regulation of CcO by physiologically active compounds including steroid and thyroid hormones and relative substances. Second, on the side we hope to solve an old biochemical problem associated with mitochondrial CcO and known almost since the middle of XX century. It is well established that some detergents used to isolate and purify CcO (e.g. Triton X-100 or deoxycholate) provide quite pure and homogenous enzyme containing all subunits and prosthetic groups but at the same time partly or completely inactive. Thus, inhibitory effect of such detergents like Triton X-100 and deoxycholate might be explained by its specific interaction with amphipathic cavity which is in contact with K channel so that bound ligand can sterically “grip” it. Such mechanism can be validated experimentally.
В 2017 году планировалось проверить действие на митохондриальную ЦО наиболее простых и активных соединений, которые, по данным группы Фергюсон-Миллер, вызывали ингибирование дыхания бактериальной ЦО. Таким образом предполагается отобрать соединения, способные потенциально взаимодействовать с консервативной амфипатической площадкой вблизи протонного канала К в каталитической субъединице I. Для соединений, проявляющих ингибиторную активность, планируется охарактеризовать ингибирование более подробно (определить С50 и максимальную степень ингибирования).
Подобрана группа детергентов и физиологически активных соединений, ингибирующих бычью ЦО и, видимо, связывающихся с амфипатической площадкой в субъединице I для дальнейшего исследования.
Проверено действие на ЦО из сердца быка ряда детергентов: холата, дезоксихолата, тритона Х-100, CHOBIMALT, холестерил-гемисукцината. Все проверенные детергенты, за исключением холестерил-гемисукцината, оказывали выраженное ингибирующее действие на дыхание митохондриальной ЦО, окисляющей цитохром с в присутствии аскорбата и ТМФД. Наиболее ярко эффект проявлялся в случае тритона Х-100 и CHOBIMALT с полумаксимальным ингибированием при концентрации детергента около 250 μМ. Из физиологически активных соединений были протестированы стероидный мужской половой гормон тестостерон, ретиноевая кислота и билирубин. Среди них тестостерон и ретиноевая кислота проявляли ингибиторную активность, хотя и слабую (ингибирование не превышало 30%). Билирубин не ингибировал активность ЦО будучи добавлен как в среду инкубации, так и по ходу эксперимента.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 9 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Регуляция цитохром с оксидазы митохондрий за счет взаимодействия лигандов с консервативной амфипатической площадкой вблизи протонного канала К в каталитической субъединице I фермента. |
Результаты этапа: Проведено первичное исследование умеренно гидрофобных (амфифильных) лигандов, способных связываться с консервативной амфипатической площадкой каталитической субъединицы I , расположенной вблизи устья входного протонного канала К, и вызывать ингибирование ЦО сердца быка. Среди тестируемых соединений детергенты на основе желчных пигментов, дезоксихолат и холат, а также детергенты Тритон Х-100 и чобимальт (Chobimalt), проявили высокую ингибиторную активность. Получены указания на конкуренцию соединений этого типа с базовым детергентом додецилмальтозидом, который сам по себе даже в высоких концентрациях лишь в небольшой степени ингибирует фермент, но при этом сильно ослабляет ингибиторное действие Тритона Х-100. Мужской половой гормон тестостерон, и ретиноевая кислота также оказались способны в той или иной степени ингибировать дыхание бычьей ЦО. Некторые другие природные соединения сходной структуры, такие как холестерил-гемисукцинат и билирубин, заметного воздействия на ферментативную активность не оказывали. Получены предварительные данные, что 0.4 мМ чобимальт не оказывает заметного влияния на ферроцианид-пероксидазную ативность ЦО. Та же концентрация чобимальта вызывает ингибирование цитохром с оксидазной активности фермента более чем на 60% . Этот результат подтверждает нашу гипотезу о действии амфифильных лигандов на входной протонный канал К и имеет приоритетный характер. | ||
2 | 9 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Регуляция цитохром с оксидазы митохондрий за счет взаимодействия лигандов с консервативной амфипатической площадкой вблизи протонного канала К в каталитической субъединице I фермента. |
Результаты этапа: Проведен подробный анализ механизма действия Тритона-X100 (TX), как представителя класса амфифильных лигандов, ингибирующих цитохромок- сидазу (ЦО). TX полностью подавляет кислород-редуктазную (оксидазную) активность ЦО, выделенной из сердца быка как с естественным, так и с искусственными донорами электронов. При экстраполяции к нулевой кон- центрации додецилмальтозида (ДМ), присутствие которого необходимо для поддержания ЦО в растворимом состоянии, константа ингибирования цито- хром с оксидазной реакции составляет около 300 мкМ. Действие TX обраща- ется ДМ. Установлена количественная конкуренция между TX и ДМ за свя- зывание с ЦО. TX не влияет на спектральные характеристики восстановлен- ной или окисленной ЦО, а также на взаимодействие фермента с цианидом, что свидетельствует о нативном состоянии кислород-редуктазного центра. Показано, что TX ингибирует оксидазную активность ЦО, подавляя внут- римолекулярный перенос электронов между гемами а и а3. В то же время, пероксидазная активность ЦО, измеренная как с естественным, так и искус- ственным донорами электронов, проявляет устойчивость к ингибированию TX. Этот результат подтвержден в предварительных экспериментах с двумя другими амфифильными лигандами – деоксихолатом и чобимальтом. Ранее нами в соавторстве с лабораторией Р.Генниса (Иллинойский университет в Урбане-Шампейн) было установлено, что такой особенный тип ингибиро- вания характерен для бактериальной ЦО, в которой с помощью точечных мутаций инактивирован протонный канал К [Vygodina, T., C. Pecoraro, et al. (1998). ”Mechanism of inhibition of electron transfer by amino acid replacement K362M in a proton channel of Rhodobacter sphaeroides cytochrome c oxidase.” Biochemistry 37(9): 3053-3061]. Амфипатическая площадка, связывающая ДМ и, предположительно, конкурирующий с ДМ TX, расположена вблизи входа в протонный канал К. Представляется вероятным, что ингибиторное действие TX и других амфифильных ингибиторов также объясняется нару- шением переноса H+ через К-канал и подавлением стадий каталитического цикла ЦО, сопряженных с работой этого канала. Обнаружено, что TX оказы- вает существенное влияние на взаимопревращения кислородных интерме- диатов, возникающих в кислород-редуктазном центре ЦО при взаимодей- ствии окисленного фермента с избытком перекиси водорода. TX снижает выход оксоферрильного комплекса FI-607 и подавляет образование из пе- рекиси водорода супероксидных радикалов. Вместе с тем TX, как и в случае пероксидазной активности, лишь слабо ингибирует каталазную активность ЦО. Предложен механизм, объясняющий действие TX на взаимодействие окисленной митохондриальной ЦО с экзогенной H2O2. В предварительных опытах обнаружено, что ДМ, препятствуя игибированию ЦО Тритоном, мо- жет в то же время способствовать торможению работы фермента тестосте- роном. | ||
3 | 9 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Регуляция цитохром с оксидазы митохондрий за счет взаимодействия лигандов с консервативной амфипатической площадкой вблизи протонного канала К в каталитической субъединице I фермента. |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".