ИСТИНА

Впервые разработана система бактериальной продукции SLURP-2. Проведен анализ эффективности ренатурации различных нейропептидов семейства Ly6/uPAR (на примере SLURP-1, SLURP-2, Lynx1, WTX, цитотоксина I и мамбалгина-2) in vitro. Показано, что эффективность ренатурации зависит от индивидуальных особенностей трехпетельного белка: от количества остатков пролина в третьей петле и площади поверхности заглубленных гидрофобных остатков. Определена пространственная структура и исследована динамика молекулы SLURP-2 в растворе. Показано, что белок обладает «трех-петельной» структурой, состоящей из двух антипараллельных бета-листов. Структура SLURP-2 хорошо сформирована только в консервативном бета-структурном ядре молекулы, при этом концы всех трех петель белка разупорядочены. Данные 15N-релаксации показали значительную подвижность неструктурированных петель SLURP-2 в пс-нс диапазоне времени. На клетках колоректальной аденокарциномы человека НТ-29, экспрессирующих nAChR только α7 типа, проведено исследование действия рекомбинантных белков SLURP-1 и SLURP-2. Показано, что SLURP-1 и SLURP-2 ингибируют рост опухолевых клеток с ЕС50 ~ 0.1 и 0.2 нМ, соответственно. Полученные данные указывают на nAChR α7 типа как на главный рецептор, ответственный за антипролиферативный эффект белков SLURP в эпителиальных клетках человека. Методом аффинной экстракции субъединиц nAChR человека из гомогената ткани коры височной области мозга с помощью магнитных частиц с иммобилизованными молекулами нейропептидов впервые показано, что SLURP-2, также как и Lynx1, взаимодействует с а3, а4, а5, а7,б2 и б4 субъединицами nAChR, в то время как SLURP-1 обладает высокой избирательностью по отношению к альфа7 подтипу рецептора. Взаимодействие SLURP-2 с различными nAChRs было исследовано методами электрофизиологии на ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих а4б2, а3б2 и а7 nAChRs. Показано, что SLURP-2 ингибирует а4б2 и а3б2 nAChRs, при этом нейропептид ингибирует а7 nAChRs только при концентрации> 0,3 мкМ, а при концентрации выше 0,3 мкМ вызывает выраженный потенцирующий эффект. Показано, что при низких концентрациях (30 нМ) SLURP-2 действует как ко-агонист, потенцирующий ответ рецептора на ацетилхолин в несколько раз. Исследован эффект Lynx1, SLURP-1 и SLURP-2 на nAChR-опосредованную передачу внутриклеточных сигналов на примере никотин-индуцированного фосфорилирования ERK МАР-киназы в нейроэндокринных клетках линии PC12. Показано, что 10 мкМ Lynx1 и 10 мкМ SLURP-2 значительно ингибируют никотин-опосредованное фосфорилирование ERK в клетках PC12. При этом SLURP-1 никак не влияет на никотин-индуцированное фосфорилирование ERK МАР-киназы, что находится в соответствии с полученными данными о селективном взаимодействии SLURP-1 с а7-nAChRs. Инкубация кератиноцитов линии Неt-1A с SLURP-2 в концентрации 10 нМ и выше приводила к увеличению WST-1 активности кератиноцитов до 17 ± 2% по сравнению с контрольными клетками. Выявлена разница между действием SLURP-1, SLURP-2, и Lynx1 на кератиноциты: SLURP-1 ингибирует пролиферацию клеток с ЕС50 4 нМ, в то время как SLURP-2 усиливает ее с ЕС50 ~ 10 нМ, а Lynx1 не имеет никакого эффекта. Используя специфические ингибиторы nAChRs, - змеиный а-Bgtx и а-конотоксин MII, показано, что взаимодействие SLURP-2 с а7-nAChRs приводит к ингибированию пролиферации клеток и, наоборот, взаимодействие с а3б2 nAChRs приводит к усилению пролиферации. При этом ингибирование а7 nAChRs с помощью а-Bgtx приводило к ~ двухкратному росту клеток по сравнению с контролем. Кроме того, эксперименты с кератиноцитами в присутствии атропина показали, что SLURP-2 взаимодействует также и с mAChRs, и это взаимодействие приводит к увеличению клеточной пролиферации. Эксперименты по изучению конкуренции SLURP-2 с 3Н-меченым ортостерическим лигандом N-метилскополамином (NMS) выявили, что М1 и М3 подтипы mAChRs являются специфическими мишенями rSLURP-2, в то время как белок совсем не действует на М2, М4 и М5 подтипы рецептора. Кроме того, было показано, что SLURP-2 является аллостерическим модулятором mAChRs, усиливающим взаимодействие М1 рецептора с NMS, и уменьшающим взаимодействие лиганда с М3 рецептором. Методами компьютерного моделирования проведено сравнение комплексов mAChR с SLURP-2, Lynx1 и токсином кобры WTX, наиболее близким структурным гомологом нейропептидов человека. Показано, что в комплексе с рецептором М3 типа центральная петля WTX не закрывает вход в ортостерический сайт, расположенный ниже аллостерического сайта. Напротив, для токсина в комплексе с M1-mAChR наблюдалось погружение наиболее длинной петли II в аллостерический лиганд-связывающий вестибюль рецептора М1 типа, таким образом закрывая вход в ортостерический сайт. Для моделей комплексов SLURP-2/M3-mAChR и Lynx1/M3-mAChR наблюдалась схожесть первой модели с моделью WTX/M1-mAChR и схожесть второй модели с моделью WTX/M3-mAChR. При этом Lynx1 взаимодействует с рецептором посредством первой и второй петель из положения, допускающего его мембраносвязанное состояние, которое наблюдается в природе из-за наличия GPI-якоря. Полученные данные согласуются с наблюдаемой «положительной» и «отрицательной» аллостерией взаимодействия Lynx1 и SLURP-2 с M3-mAChR, соответственно. Исследование влияния различных лигандов на взаимодействие нейропептидов Lynx1 и SLURP-2 с а7-nAChR, выделенными из мозга крысы с помощью магнитных частиц, с иммобилизованным на их поверхности нейропептидами, показало, что SLURP-2 конкурирует с а-бунгаротоксином, а Lynx1 с MLA за связывание с а7 субъединицей. Компьютерное моделирование показало, что комплекс SLURP-2/а3б2-nAChR образован в основном контактами между петлями I и II SLURP-2 и С-петлей рецептора, аналогично тому, как это наблюдалось в комплексе Lynx1 с ацетилхолин-связывающим белком (AChBP), структурным гомологом лиганд-связывающего домена nAChR. Однако, в отличие от Lynx1, который взаимодействует с внешней стороной петли С AChBP без проникновения в ортостерический сайт, длинная петля II SLURP-2 оказывается погруженной в полость под петлей С. Комплексы SLURP-2/а7-nAChR отличались между собой не только положением петли С («открытое» и «закрытое» положение), но и топологией SLURP-2. При этом «открытая» конформация петли С в комплексах SLURP-2/а7-nAChR соответствует положению петли С в кристаллических структурах комплексов AChBP с антагонистами. При этом, в комплексах с обоими рецепторами SLURP-2 взаимодействует с внутренней стороной петли С рецептора с участием своей петли II, и интерфейсы лиганд-рецепторных взаимодействий частично перекрываются с лиганд-рецепторным интерфейсом взаимодействия а-бунгаротоксина и химеры AChBP/а7-nAChR. Получены мутантные варианты SLURP-2 со следующими заменами в первой, второй и третьей петлях: F9A, R17A, R20A, D21A, R31A, E37A, D38A, D52A, Y61A. Методами электрофизиологии на ооцитах было показано, что введение мутаций в третью петлю (D52A, Y61A) заметно уменьшает ингибирующую активность мутантных нейропептидов на а3б2-nAChR (на ~ 50% по сравнению с SLURP-2). Небольшие изменения в активности наблюдались для мутантных вариантов с заменами во второй петле (на ~ 15-20 % по сравнению с SLURP-2), в то время как замены в первой петле никак не влияли на активность нейропептида. В случае а7-nAChR, замены в первой петле также никак не влияли на активность SLURP-2, замены во второй петле приводили к усилению активности нейропептида до 50%, а замены в третьей петле приводили к полной инактивации SLURP-2. Проведено исследование влияния мутантных вариантов нейропептидов SLURP-1 и SLURP-2 на пролиферацию и процессы апоптоза в клетках линии Het-1A. Для SLURP-1 показано, что замены в петлях I и III приводили к уменьшению антипролиферативной активности SLURP-1 (замены остатков 59, 61, 67). Замены во второй петле наоборот усиливали антипролиферативную активность нейропептида (38,39,40,41, ингибирование пролиферации на 60-70%). Также к усилению антипролиферативной активности приводили замены остатков 74 и 76, локализованные в «голове» SLURP-1 (ингибирование пролиферации 55 и 80%, соответственно). Показано, что действие мутантных вариантов SLURP-1 с заменами R74A и L76A связано с индукцией апоптоза. Для SLURP-2 было показано, что мутации во второй и третьей петлях, а также в «голове» нейропептида приводят к «переключению» активности, стимулирующей рост клеток, на антипролиферативную. Наиболее выраженная антипролиферативная активность наблюдалась для мутантов с заменами в третьей петле (D52A, Y61A, ингибирование роста клеток на ~ 30%). По данным сайт-направленного мутагенеза проведено уточнение моделей комплексов SLURP-1/nAChR и SLURP-2/nAChR. Показано, что SLURP-1 также как и Lynx1 взаимодействует с внешней стороной петли С рецептора, прикрывающей ортостерический сайт, без проникновения в лиганд-связывающий сайт. При этом петля С находится в положении, прижатой к оси рецептора и соответствующем положению петли в комплексах с агонистами. Напротив, в уточненной модели комплекса SLURP-2/nAChR нейропептид взаимодействует с рецептором, формируя множественные контакты между второй и третьей петлями и ортостерическим сайтом рецептора, помещая петлю III под петлю С рецептора, имеющей «открытую» конформацию ортостерического сайта. Похожая картина была получена и для комплекса WTX/nAChR. Проведено исследование влияния Lynx1, SLURP-1 и SLURP-2 на пролиферацию клеток легочной карциномы человека линии А549. Показано, что Lynx1 и SLURP-1 ингибируют рост опухолевых клеток (на 17% и 35%, соответственно), а SLURP-2 стимулирует рост клеток на ~40% при концентрации 1 мкМ и инкубации с клетками в течение 48 часов. Исследовано влияние нейропептидов SLURP-1 и SLURP-2 на пролиферацию клеток эпидермоидной карциномы человека линии А431. Показано, что в этих клетках экспрессируются многие субъединицы nAChR (а1, а3, а4, а7, а9, а10). Показано, что SLURP-1 и SLURP-2 ингибируют рост опухолевых клеток (на 28% и 33%, соответственно) при концентрации 0,1 нМ и инкубации с клетками в течение 24 часов. Получены дозозависимые кривые ингибирования SLURP-1 и SLURP-2 с EC50 ~ 10 pM и 1 pM, соответственно. Исследовано взаимодействие трехпетельных нейротоксинов с GABAА-рецепторами (гомологичными рецепторами по отношению к nAChR) на примере «короткого» нейротоксина II и «длинного» химерного варианта токсина с удлиненной центральной петлей, идентичной петле нейротоксина I. Показано, что химерный токсин, в отличие от природного нейротоксина II, приобрел способность взаимодействовать с а1бета3гамма2 GABAА-рецептором, что указывает на еще одну возможную мишень нейропептидов семейства Ly6/uPAR. Проведен сравнительный анализ полученных данных и предложено описание механизмов действия эндогенных нейропептидов. Полученные данные позволяют рассматривать SLURP-1 и его мутантные варианты с заменами в положениях 74 и 76 в качестве перспективных пептидов для дальнейших новых прикладных разработок в области таргетной терапии рака. Данные, описывающие 2х-кратное увеличение пролиферативной активности SLURP-2 при прединкубации клеток с а-бунгаротоксином, позволяют рассматривать этот нейропептид в комбинации с а-бунгаротоксином как перспективный ранозаживляющий препарат. Селективный «priming» эффект, наблюдаемый для SLURP-2 в низких концентрациях на а7-nAChR и приводящий к 5ти кратному увеличению ацетилхолин-индуцированного тока через канал рецептора, указывает на перспективность использования этого нейропептида для разработок в области новых препаратов для улучшения когнитивных функций. Таким образом, выполнение Проекта 2014 позволило получить не только новые научные знания о нейропептидах человека Lynx1, SLURP-1, SLURP-2, но и результаты, имеющие практическую ценность для дальнейших разработок области биотехнологии, фармакологии и биомедицины. Результаты проекта представлены в виде 10 публикаций в международных рецензируемых журналах, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science Сore Сollection), включая такие журналы как Scientific Reports (IF 5.2), Neurobiology of Aging (IF 5.2), J.Biol.Chem. (IF 4.6), PLOS One (IF 3.6) и Toxicon (IF 2.4).