ИСТИНА

Основная цель исследования состояла в выявлении того, как сказывается структурно-функциональное разнообразие клеточного центра на топологии органелл (полярной или неполярной) при клеточной дифференцировке. Та же проблема касается клеток, в которых клеточный центр еще не сформирован (ранние стадии эмбрионального развития) или уже распался (в результате определенных вариантов дифференцировки или при апоптозе). Предполагалось сопоставить характер организации центросомы и отдельных элементов цитоскелета с расположением и тонким строением таких мембранных органелл, как ядро, аппарат Гольджи, митохондрии, лизосомы, эндосомы. Подобное исследование предполагалось провести на нормальных дифференцированных клетках, на клетках, утративших нормальный фенотип в результате трансформации или при химических воздействиях (влияющих на структурно- функциональное состояние отдельных элементов цитоскелета и/или мембранных органелл, а также вызывающих блокирование пролиферации или апоптоз). Полученные результаты должны способствовать пониманию роли центросомы в становлении и поддержании закономерной топологии мембранных органелл в процессе дифференцировки и гибели клеток.

1. Проведено электронно-микроскопическое исследование эмбрионов моллюска Lymnaea stagnalis до стадии 16 бластомеров. Получены предварительные данные о том, что до стадии 8 бластомеров центросома функционирует лишь в качестве центра организации микротрубочек веретена делений дробления. При этом интерфазные бластомеры лишены клеточного центра, а аппарат Гольджи представлен диктиосомами, рассеянными по цитоплазме. На стадиях 12-16 бластомеров в отдельных бластомерах обнаруживается клеточный центр, вблизи которого наблюдается единый аппарат Гольджи. Пока остается неясным, во всех ли бластомерах центросома начинает функционировать, как центр организации цитоплазматических микротрубочек, или формирование клеточного центра в разных бластомерах протекает асинхронно. Также пока нельзя сказать, формируется ли клеточный центр именно в тех бластомерах, в которых восстанавливается синтез РНК в ядре, либо эти события не взаимосвязаны. Далее обнаружено, что до стадии 16 бластомеров в клетках отсутствуют первичные реснички. Это означает, что центросома приобретает способность образовывать первичную ресничку после ее активации в качестве центра организации цитоплазматических микротрубочек. Начато исследование более поздних стадий эмбрионального развития моллюска L. stagnalis (от 32 бластомеров до стадии прототроха). 2. Проведено электронно-микроскопическое исследование диплоидных гепатоцитов печени в ранний период постнатального развития мыши. Полиплоидные гепатоциты взрослых животных были исследованы ранее. Обнаружено, что центросома диплоидных гепатоцитов может иметь строение, характерное для G1-, S- и G2- фаз клеточного цикла и принципиально не отличается от таковой в полиплоидных клетках (регенерирующая печень взрослых животных). Число центриолей в обоих случаях соответствует плоидности гепатоцитов. Единственным отличием центросомы диплоидных гепатоцитов является ее более низкий уровень активности в качестве ЦОМТ. Остается неясным, связано ли это с меньшим объемом диплоидных гепатоцитов по сравнению с полиплоидными, или это определяется меньшей функциональной активностью гепатоцитов (более низким уровнем синтетических процессов, процессов эндо- и экзоцитоза) молодых животных. Далее обнаружено, что в диплоидных гепатоцитах, также как и в полиплоидных, аппарат Гольджи представлен двумя комплексами - один обращен в сторону пространства Диссе, второй - в сторону желчных капилляров. Таким образом, характер полярности гепатоцитов у новорожденных и взрослых животных сходен. Кроме того, исследована ультраструктура клеток быстро- и медленнорастущей гепатом, культивируемых in vitro. Обнаружено, что в обоих вариантах клеток центросома проявляет низкую активность в качестве ЦОМТ, однако клеточный центр выражен и рядом с ним располагается единый аппарат Гольджи. Таким образом, полярность клеток гепатомы, выращенных на твердом субстрате, принципиально не отличается от других культивируемых эпителиальных клеток, но иная, нежели полярность гепатоцитов in vivo независимо от уровня плоидности клеток. 3. Для ответа на вопрос о том, происходит ли реорганизация аппарата Гольджи при распаде клеточного центра, исследованы два типа дифференцированных клеток, утративших клеточный центр в ходе дифференцировки - зрелые мегакариоциты костного мозга мыши и ресничные клетки эпителия ноги прудовика. Обнаружено, что при созревании мегакариоцитов происходит распад как клеточного центра, так и аппарата Гольджи. При этом многочисленные центриоли и диктиосомы рассеиваются по цитоплазме независимо друг от друга. В ресничных клетках эпителия ноги моллюска, несмотря на отсутствие клеточного центра, диктиосомы собраны в единый аппарат Гольджи в апикальной части клетки. Такая организация ресничных клеток наблюдается как у молодых моллюсков, так и у взрослых. Зрелый мегакариоцит, у которого отделение тромбоцитов идет по всей поверхности, может служить примером клетки, лишенной признаков как внешней, так и внутренней полярности в расположении органелл, в отличие от строго поляризованных ресничных клеток. По-видимому, к отсутствию каких-либо черт внутренней полярности клетки может вести деструкция именно тех компонентов, которые и обеспечивают векторность в расположении органелл и течении внутриклеточных процессов, таких как эндо- и экзоцитоз. 4. Предпринята попытка проверить, влияет ли нарушение синтеза ДНК, вызванное арабинозидаденином, на созревание эритроцитов и состояние клеточного центра в клетках эритроидного ряда. Обнаружено, что 24-часовое воздействие данным агентом не приводит к изменению формулы крови, т.е. не влияет на процесс созревания эритроцитов. Начато исследование ультраструктуры клеток эритроидного ряда в костном мозге. По предварительным данным каких-либо отличий в состоянии клеточного центра в таких клетках по сравнению с клетками в норме не обнаружено. 5. Проведен анализ полутолстых (2-4мкм) срезов митотических и интерфазных меланофоров (с дисперсным и агрегированным расположением гранул) и трехмерная реконструкция на основе этих срезов. Для трехмерной реконструкции использована программа 3D Studio Release 6. Обнаружено, что меланофоры являются отросчатыми клетками, переход которых из агрегированного состояния в дисперсное в интерфазе и из интерфазы в митоз сопровождается изменением клеточной формы. Это означает, что реорганизация клеточного центра, которая наблюдается у меланофоров при движении гранул или при переходе из одной фазы клеточного цикла в другую, сопровождается изменением формы клеток. 7. Для решения вопроса о том, существует ли взаимосвязь между состоянием ядерных структур (степень конденсации хроматина, структура ядрышка) и состоянием клеточного центра отрабатывается метод компьютерного анализа электронно-микроскопических изображений ядрышек и хроматина ядер клеток. Для этого электронно-микроскопические изображения ядер клеток Vero переведены в компьютерные изображения с помощью компьютерного комплекса для анализа изображений. При оценке оптической плотности разных участков ядра и ядрышек используется компьютерная программа Adobe Photoshop 5. Данный анализ может позволить составить представление о характере компактизации хроматина при разном физиологическом состоянии клеток и на разных стадиях клеточного цикла. Для изменения физиологического состояния клеток культуру помещали на 2 суток в среду с низким содержанием сыворотки и затем культивировали в стандартных условиях (2 и 8 часов). Получены предварительные данные о том, что в условиях низкой сыворотки у части клеток хроматин и ядрышко компактизованы в большей степени, нежели в клетках, выращиваемых в стандартных условиях. По-видимому, это клетки, находящиеся в G0- периоде. При исследовании ультраструктуры можно отметить определенное разнообразие по количеству микротрубочек и промежуточных филаментов в области клеточного центра. В дальнейшем предстоит выяснить, чем же определяется наблюдаемое нами разнообразие клеток по степени компактизации ядерных структур и по характеру организации клеточного центра.