ИСТИНА

Основной целью исследований являлось получение структурно-функциональной характеристики клеточного центра на разных этапах онтогенетического развития организма. Предполагалось проследить этапы формирования клеточного центра в раннем эмбриогенезе, проанализировать поведение его отдельных элементов (центриолей, центросомы и комплекса Гольджи) при дифференцировке различных типов клеток и определить особенности изменений в состоянии клеточного центра при программируемой смерти клеток (апоптозе). Параллельно педпологалось исследовать поведение органелл, прилежащих к клеточному центру, и цитоскелета, взаимодействующего с ним. Полученные результаты позволили бы использовать структурно-функциональные характеристики клеточного центра и его микроокружения в качестве критерия при оценке степени дифференцированности клеток или уровня развития патологических процессов, сопровождающих апоптоз.

Исследования, выполненные коллективом научных сотрудников, были направлены на выявление клеточного центра и анализ структурно-функционального состояния центросомы в различные периоды онтогенеза у некоторых многоклеточных животных. Наряду с исследованиями клеточного центра большое внимание обращали на особенности организации цитоскелета и поведение мембранных органелл, окружающих клеточный центр. При этом прежде всего исследовали локализацию и тонкую организацию аппарата Гольджи, локализацию и функциональное состояние лизосом и митохондрий. Помимо исследования дифференцированных клеток в норме анализировали также апоптические клетки. Проведенные исследования показали, что у некоторых моллюсков (Lymnaea stagnalis, Phyza rubra) на начальных стадиях эмбрионального развития центросома, имеющая гибридное происхождение (отцовское и материнское), способна обеспечивать сборку митотических микротрубочек и формирование собственно центриолей, но не участвует в организации интерфазных микротрубочек (Krioutchkova et al., 1994b; Виноградова и др., 1996; Vinogradova, Onishchenko, 1999 ; Krioutchkova, Onishchenko, 1999). В результате в начальный период эмбриогенеза в клетках отсутствует такое образование, как клеточный центр. При этом диктиосомы аппарата Гольджи дисперсно распределены по цитоплазме. Далее обнаружено, что при дифференцировке клеток возникает широкое разнообразие по таким признакам, как присутствие или отсутствие клеточного центра, активность центросомы в качестве центра организации различных категорий микротрубочек, локализация и организация аппарата Гольджи. Результаты наших исследований показывают, что в дифференциированных клетках возможны следующие варианты поведения клеточного центра и аппарата Гольджи: 1.Клеточный центр отсутствует, так как центросома не активна в качестве организатора любых категорий микротрубочек (центриолярных, цитоплазматических, митотических, аксонемных - зрелые яйца моллюсков - Krioutchkova et al., 1994b; Виноградова и др,1996; Krioutchkova, Onishchenko, 1999, нормобласт мыши) и аппарат Гольджи в виде диктиосом дисперсно распределен по цитоплазме. 2. Клеточный центр отсутствует, центросома включает центриоли, но не активна в качестве центра организации цитоплазматических микротрубочек (Онищенко, 1978), и аппарат Гольджи в виде диктиосом дисперсно распределен по цитоплазме (гепатоциты интактной печени). 3. Клеточный центр существует, так как центросома активно функционирует в качестве центра организации микротрубочек - цитоплазматических и митотических, однако диктиосомы аппарата Гольджи дисперсно распределены по цитоплазме (меланофоры шпорцевой лягушки) (Rubina et al., 1999 в). 4. В клетке присутствует как клеточный центр с активно работающей центросомой, так и единый комплекс Гольджи (гепатоциты регенерирующей печени (Онищенко, Ченцов, 1986;), ворсинчатые клетки эпителия ноги моллюска, клетки эритроидного ряда дифференцировки вплоть до полихроматофильного эритробласта). В ходе клеточного цикла как центросома, так и комплекс Гольджи претерпевают закономерные изменения - с началом пролиферации клеток центросома начинает активно организовывать цитоплазматические микротрубочки и вокруг клеточного центра формируется область центросферы. Комплекс Гольджи локализуется только вблизи клеточного центра. К концу интерфазы центросома редуплицируется и начинает образовывать митотические микротрубочки. Комплекс Гольджи сохраняет околоцентросомальную локализацию. Исследования организации клеточного центра в клетках гепатомы, растущей в культуре, показали, что как и в пролиферирующих гепатоцитах мыши, в клетках гепатомы присутствует центросома, активная в качестве ЦОМТ. При этом аппарат Гольджи в виде комплекса диктиосом занимает обширную область вокруг клеточного центра. В многоядерных клетках гепатомы также присутствует единый клеточный центр, окруженный мощно развитым аппаратом Гольджи. 5. Клеточный центр отсутствует, а в качестве структур, организующих цитоплазматические микротрубочки и микротрубочки аксонемы, функционируют базальные тела. При этом в клетке существует единый комплекс Гольджи (ресничный эпителий ноги моллюска). 6. Клеточный центр отсуствует, центросома в форме базального тела организует центриоли сперматозоида и микротрубочки аксонемы жгутика, но аппарат Гольджи видимой целостной структуры не имеет (зрелые сперматозоиды моллюсков - Кrioutchkova, Onishchenko, 1999). Исследования, проведенные на культивируемых клетках, показали, что при нарушении активности центросомы в качестве ЦОМТ (начальные сроки после слияния клеток - Яровая, Онищенко, 1997; Яровая и др, 1997, ранние стадии апоптоза) элементы аппарата Гольджи могут быть рассеянными по цитоплазме (как в бластомерах моллюсков или гепатоцитах интактной печени мыши). При этом в клетках присутствуют микротрубочки, не ассоциированные с центросомой. Если в дальнейшем происходит активации центросомы в качестве ЦОМТ, возможно быстрое формирование единого комплекса Гольджи (поликарионы на определенных стадиях жизненного цикла - Яровая, Онищенко, 1997; Яровая и др, 1997). Для нарушения общей организации цитоскелета можно использовать в качестве модели отделение клеток от подложки и последующее их распластыввание на твердом субстрате. Проведенные нами на такой модели исследования состояния центросомы и поведения различных органелл показали, что на разных стадиях распластывания не наблюдается существенных различий в уровне активности центросомы в качестве ЦОМТ. При этом в процессе распластывания клеток происходит закономерное перераспределение таких органелл как аппарат Гольджи, лизосомы и митохондрии. При действии ингибиторов энергетического обмена происходит усиление выраженности цитоскелетных структур (микротрубочек и промежуточных филаментов), связанное, по-видимому, с нарушением их разборки. При сохранении в клетке низкого содержания АТФ распластывание клеток усиливается, лизосомы перемещаются в область клеточного центра, митоходрии меняют свою структуру и располагаются хаотично. Аппарат Гольджи уменьшается в объеме по сравнению с контролем. При полном ингибировании синтеза АТФ распластывание клеток замедляется, лизосомы и митохондрии оказываются рассеянными по цитоплазме, структура митохондрий резко изменяется. Аппарат Гольджи значительно увеличивается в объеме. Данные исследования показывают, что закономерное распределение органелл может зависеть не только от активности центросомы в качестве ЦОМТ, но и от свойств микротрубочек, ею организуемых (Kisurina-Evgenieva, Onishchenko, 1999, Кисурина-Евгеньева, Онищенко, 2000 а,б). Для анализа состояния клеточного центра при обратимом разрушении микротрубочек проведена эспериментальная разборка микротрубочек на меланофорах лягушки . При воздействии колцемидом обнаружено, что в зависимости от физиологического состояния клетка имеет разные по стабильности микротрубочки - микротрубочки в дисперсных меланофорах существенно стабильнее микротрубочек в агрегированных меланофорах. Структура центросомы интерфазных меланофоров чувствительна к воздействию возрастающих концентраций колцемида (10 - 10 М). Повышение концентрации колцемида до 10 М - вызывает коллапс центросомы в агрегированных меланофорах. Колцемид в концентрации 10 М не препятствует действию МСГ, который индуцирует дисперсию меланосом, при этом в некоторых клетках наблюдается инактивация центросомы в качестве ЦОМТ. Мелатонин же в присутствии колцемида вызывает аномальную агрегациию, при этом в ряде клеток происходит активация центросомы в качестве ЦОМТ (Rubina et al., 1999 ). Для исследования клеточного центра в апоптических клетках разработано две модели - апоптические клетки, индуцированные: 1. В культуре клеток с помощью сывороточного голодания (в три раза больше по сравнению с контролем) или воздействием арабинозидаденином (в четыре раза больше по сравнению с контролем); 2. В эпителии кишки мыши при индукции воздействием арабинозидаденином (в три раза больше по сравнению с в контроле). В апоптических клетках эпителия кишки мыши обнаружена инактивация центросомы в качестве ЦОМТ, распад клеточного центра и распад аппарата Гольджи до уровня диктиосом. Отдельные диктиосомы аппарата Гольджи могут оказываться в составе апоптических телец. Таким образом, можно полагать, что присутствие клеточного центра связано с активностью центросомы в качестве ЦОМТ. Сборка же единого комплекса Гольджи не требует существования клеточного центра. Определяющим фактором для этого процесса является, по-видимому, собственно сборка микротрубочек (как в связи с центросомой, так и в связи с другими структурами, например, базальными телами) и то, какого типа микротрубочки при этом образуются.