ИСТИНА

С каждый годом число устойчивых бактериальных штаммов возрастает, в то же время темпы создания новых антимикробных препаратов снижаются. Бактериальные инфекции представляют угрозу не только для стран третьего мира, но и для развитых. В связи с ростом числа резистентных штаммов в ближайшие десятилетия смертность от бактериальных инфекций может возрасти в разы или даже десятки раз. В связи с этим крайне актуальным является задача поиска новых антибиотиков. Большинство известных антибиотиков действуют по трем механизмам: нарушение синтеза клеточной стенки, синтеза нуклеиновых кислот или синтез белка. Более половины известных антибиотиков нарушают синтез белка, несмотря на структурную схожесть бактериальной и эукариотической рибосом, удается обнаружить такие небольшие молекулы, которые специфически ингибируют работу бактериальной. Кроме очевидного практического применения ингибиторы трансляции помогают разобраться в фундаментальных основах функционирования рибосомы. Рибосома, один из самых сложных рибонуклеопротеидных комплексов в клетке, осуществляют синтез белка, за счет координации сразу многих процессов: декодирование, пептидилтрансферазная реакция, движение рибосомы по мРНК и т.д. Все эти стадии могут быть специфически остановлены под действием различных антибиотиков. Это позволило провести структурные и биохимические исследования рибосомы в переходных функциональных состояниях, дав уникальную информацию о механизме работы аппарата трансляции. Нами разработана уникальная система скрининга, позволяющая in vivo в высокопроизводительном режиме определять механизм действия антибиотика, одновременно с оценкой эффективности его действия. В ходе выполнения проекта планируется проанализировать не менее десяти тысяч индивидуальных химически синтезированных и природных соединений и отобрать те, которые подавляют рост бактериальных клеток за счет нарушения процесса синтеза белка. Одновременно с этим будет проводиться оптимизация молекул-лидеров (см. задел), обнаруженных нашей группой ранее, при выполнении договора о предоставлении субсидии Минобрнауки 14.607.21.0086 (окончание 31.12.2016) и продемонстрировавших ингибирование трансляции. В данном проекте планируется исследовать обнаруженные ингибиторы и их производные с помощью как биохимических, так и структурных методов, таких, как рентгеноструктурный анализ (РСА) и криоэлектронная микроскопия (криоЭМ). Структурные данные позволят проводить рациональную оптимизацию молекул, основываясь на их месте их связывания с бактериальной рибосомой. Оптимизированные молекулы будут проверены на клинически значимых штаммах и, возможно, могут быть использованы для создания новых антимикробных лекарств. В лаборатории профессора Вилсона, немецкого партнера данного проекта, налажен метод криоЭМ комплексов рибосома-антибиотик. В ходе реализации проекта, кроме изучения новых синтетических соединений, планируется исследовать такие природные антибиотики как миксоваларгин, эланзолид и апидацин. Структура комплекса данных ингибиторов трансляции с рибосомой не известна, однако, предварительные данные показали возможность использования метода криоЭМ для решения данной задачи.

With each year the number of resistant bacterial strains is increasing, at the same time the pace of development of new antimicrobials is reduced. Bacterial infections are a threat not only to the third world countries, but also for developed countries. Due to increasing number of resistant strains during last years, mortality from bacterial infections may increase at times or even dozens of times. So, the finding new antibiotics becomes very urgent task for molecular biology. Most of the known antibiotics act by three mechanisms: impaired cell wall synthesis, nucleic acid synthesis or protein synthesis. More than half of the known antibiotics disrupt translation, despite the structural similarity between the bacterial and eukaryotic ribosomes, it is possible to finf such small molecules that specifically inhibit bacterial translation. Apart from the obvious practical application, translation inhibitors help to understand the fundamentals of the functioning of the ribosome. Ribosome is one of the most difficult ribonucleoprotein complexes in the cell, the protein synthesis is carried out, by directly coordinating several processes: decoding, the peptidyl transferase reaction, translocation, etc. All these steps can be specifically stopped by antibiotics. It is possible to carry out structural and biochemical studies of the ribosome in the transition of functional states, obtaining unique information about the mechanism of translation. We have developed a unique screening system that allows in vivo in high throughput manner to determine the mechanism of antibiotic action, simultaneously with measuring the efficiency. During the project, it is planned to analyze at least ten thousand of individual chemically synthesized and natural compounds and to select those which inhibit the growth of bacterial cells by disrupting the protein synthesis process. At the same time the molecules leaders (see. preliminary work) discovered by our group earlier, when the contract for the Ministry of Education grants 14.607.21.0086 (ending 31.12.2016) and demonstrated inhibition of translation, will be optimized. In this project, it is planned to investigate the detected inhibitors and their derivatives using both biochemical and structural techniques such as x-ray crystallography (XRC) and Cryo-electron microscopy (Cryo EM). The structural data will allow to carry out a rational optimization of molecules, based on their place of binding to the bacterial ribosome. Optimized molecules will be tested on clinically significant strains and may be used to create new anti-microbial drugs. In Professor Wilson laboratory, the German partner of the project, Cryo EM of ribosome-antibiotic complexes is adjusted. During project, in addition to the study of new synthetic compounds, natural antibiotics myxovalargin, elansolid and apidaecin will be analisied. Structure of these translation inhibitors is not known, however, preliminary data showed the ability of Cryo EM using for solving this problem.

Будет проанализирована антибактериальная активность большого набора (не менее десяти тысяч) химически синтезированных соединений и природных соединений, продуктов метаболизма почвенных и других микроорганизмов и проведена их классификация по механизму действия. На данный момент разработанная нами репортерная система является наиболее эффективной по скорости проведения эксперимента и себестоимости, она позволяет детектировать антибиотики, действующие на рибосому, а также вызывающие повреждения ДНК. Найденные в ходе запланированного в рамках данного проекта скрининга, а также обнаруженные нами ранее, новые ингибиторы синтеза белка будут оптимизированы с целью повышения их эффективности и селективности. Для этого будут проведены комплексные структурные исследования методами РСА и криоЭМ. Для оптимизированных молекул будет оценена эффективность подавления роста набора клинически значимых бактериальных патогенов, а также токсичность по отношению к клеткам человека. Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых лекарств и подходов к лечению инфекционных заболеваний. Также будут определены структуры комплекса антибиотик-рибосома для набора интересных ингибиторов трансляции - миксоваларгина, эланзолида и апидацина, предварительные эксперименты уже показали возможность использования данного метода для решения поставленной задачи.Исследование новых ингибиторов рибосомы востребовано мировым научным сообществом. Структурно-функциональные исследования подобного рода публикуются в высокорейтинговых научных журналах (Bulkley D, et al., Cell Rep. 2014 6:357-65; Polikanov et al., Mol Cell. 2014 56:541-50; Svidritskiy E, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2013 110:12283-8). Имеющиеся публикации нашей группы (Polikanov YS*, Osterman IA* et al., Mol Cell. 2014 56:531-40.* авторы, внесшие равный вклад в работу; Osterman IA. et al., Antimicrob Agents Chemother. 2016) и группы профессора Вилсона (Arenz S, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2016 113:7527-32; Seefeldt AC, et al., Nucleic Acids Res. 2016 44:2429-38; Polikanov YS, et al., Mol Cell. 2015 58:832-44; Seefeldt AC, et al., Nat Struct Mol Biol. 2015 22:470-5) также свидетельствуют о высоком интересе международного научного сообщества к данной теме, ее уровне и актуальности.

Работа по выполнению проекта будет осуществляться группой И. Остермана в Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова в сотрудничестве с группой профессора Д. Вилсона из Университета Гамбурга, Германия. Кроме того, имеется договоренность о сотрудничестве обеих участвующих групп при выполнении данной работы с группой Ю. Поликанова, Университет Иллинойса, Чикаго (без финансовой поддержки фондами РНФ и DFG). Все участники проекта имеют существенный задел и успешный опыт работы по исследованию антибиотиков, действующих на рибосому. Группой И. Остермана разработаны сенсорные репортерные штаммы для выявления ингибиторов трансляции. Первый вариант такого репортерного штамма был создан в 2012 году (Osterman I.A., et al., 2012. Antimicrob Agents Chemother. 56:1774-83). В 2016 году, при выполнении договора о предоставлении субсидии Минобрнауки был создан усовершенствованный вариант репортерного штамма с улучшенными характеристиками (Osterman I.A., et al., 2016. Antimicrob Agents Chemother. В печати) и найдены два семейства лидерных молекул – ингибиторов биосинтеза белка. С помощью созданных репертерных штаммов было определено, что малоизученный антибиотик амикумацин А ингибирует трансляцию, а затем его механизм действия был подробно изучен структурными и биохимическими методами. Эта работа положила начало успешному сотрудничеству группы И. Остермана и Ю. Поликанова (Университет Иллинойса), приведшая к публикации в журнале Molecular Cell