ИСТИНА

Проект направлен на выяснение молекулярного механизма электрогенного переноса ионов водорода и сопряжения его с переносом электронов в ходе кислород-редуктазной реакции, катализируемой цитохромоксидазой. 1. Одной из основных задач является идентификация промежуточных стадий переноса электронов и протонов в ходе каталитического цикла цитохромоксидаз семейства A (на примере классической цитохромоксидазы аа3 из Rhodobacter sphaeroides) с использованием как нативных, так и полученных с помощью направленного мутагенеза бактериальных цитохромоксидаз с заменами ключевых функционально значимых аминокислотных остатков. Замена в протон-проводящем D-канале ключевого аминокислотного остатка N139 (N139L или N139D) лишает фермент способности к стационарному трансмембранному переносу протонов, сохраняя (N139D) или частично ингибируя (N139L) кислород-редуктазную активность. Конкретной задачей является комплексное изучение кислород-редуктазной реакции и сопряженного электрогенного переноса протонов в ферменте с мутациями N139L и N139D с целью выяснить причину специфического отключения протонного насоса в ферменте, вызванного этими мутациями. 2. Продолжить исследование малоизученного с функциональной точки зрения каталитического цикла цитохромоксидазы ba3-типа из Thermus thermophilus, для которой характерна сниженная эффективность сопряженной трансмембранной перекачки протонов. Целью является выяснить сопряжены ли одноэлектронные переходы (OH->EH и EH->R) в восстановительной части каталитическом цикла цитохромоксидазы ba3 с трансмембранным переносом протона. Предполагается продолжить исследование прямым электрометрическим методом предстационарной кинетики одноэлектронного фотовосстановления цитохромоксидазы ba3-типа, переведенной в окисленное активированное состояние OH. Планируется использовать множественные последовательные инъекции электрона в активированный фермент. По мере роста числа вспышек (инъекций электрона) в этих условиях в канонических аа3 оксидазах, наряду с электрогенными событиями в ходе OH->EH перехода наблюдается постепенное накопление состояния EH и возникновение в части популяции фермента электрогенных событий, вызванных переходом в двухэлектронное состояние (EH->R). 3. Начать исследование цитохромоксидазы caa3 из Thermus Thermophilus. С функциональной точки зрения этот фермент ранее практически не изучался кинетическими методами с временными разрешением. В то же время он обладает рядом необычных свойств, позволяющих использовать его как объект для получения дополнительной информации о механизме работы цитохромоксидазы. Это отсутствие ряда ключевых аминокислотных остатков в протон-проводящих каналах, а также ковалентно-связанный с ферментом цитохром с. Поскольку реакция окисления полностью восстановленной классической аа3 оксидазы кислородом в режиме одного оборота фермента заканчивается полностью окисленным состоянием (O или OH), наличие дополнительного гемового центра в caa3 оксидазе предполагает возможность нативного исследования дополнительной одноэлектронной стадии (O->E), входящей в малоизученный стартовый участок каталитического цикла цитохромоксидазной реакции.

1. Исследованы электрогенные фазы переноса зарядов и кинетики спектральных изменений гемовых центров в ходе переноса электрона, наблюдающихся при фотоиндуцированном одноэлектронном восстановлении с помощью трис(бипиридил)рутения в цитохромоксидазе aa3-типа из Rhodobacter sphaeorides дикого типа и с мутациями N139D и N139L. Получена информация, позволяющая провести уточненное массштабирование электрогенных фаз в кинетике сопряженного переноса протонов в цитохромоксидазе. Установлено, что специфическая замена N139L в протонном D-канале цитохромоксидазы из Rhodobacter sphaeroides приводит к 15-кратному снижению числа оборотов фермента и потери способности к помпированию протонов. Разрешенное во времени измерение оптического поглощения и электрометрии в переходе F->O мутантной оксидазы N139L привело к трем основным заключениям: (1) Окисление восстановленного фермента кислородом демонстрирует ~200-кратное ингибирование стадии F->O (k~2 c-1 при pH 8), что значительно медленнее числа оборотов мутантного фермента (~30 c-1). Предполагается, что в данных условиях образуется нетипичный интермедиат Fdeprotonated, характеризующийся по сравнению с обычным состоянием F протонной вакансией. Напротив, переход F->O мутантной N139L оксидазы, индуцированный одно-электронным фотовосстановлением образованного в реакции окисленного фермента с H2O2 интермедиата F, замедляется в той же степени, что и число оборотов фермента. (2) В мутантной N139L оксидазе, протонная фаза генерации ??, сопряженная со свето-индуцированным F->O переходом, снижается по скорости и амплитуде и может быть отнесена к движению протона от остатка E286 к биядерному центру, необходимого для восстановления гема a3 из оксоферрильного Fe4+=O2- состояния в окисленное Fe3+-OH-. Электрогенное репротонирование остатка E286 из внутренней водной фазы отсутствует в переходе F->O данного мутанта. (3) В мутанте N139L, нечувстивтельная к KCN быстрая электрогенная часть ответа состоит их двух компонент с характеристическими временами ~10 и ~40 мкс и соотношением амплитуд ~3:2. Быстрая компонента 10 мкс соответствует векторному переносу электрона от CuA к гему a, в то время как 40 мкс компонента может быть отнесена к внутрибелковому перемещению протона на расстояние ~20% толщины мембранного диэлектрика. Данное перемещение протона может запускаться вращением остова заряженного остатка K362, сопряженного с восстановлением гема а. Две компоненты быстрой электрогенной фазы были разрешены также в случае оксидаз с другими мутациями в D-канале, а также в оксидазе дикого типа, заингибированной цианидом. Данное наблюдение позволило согласовать необычно высокое значение амплитуды микросекундной электрогенной фазы в бактериальном ферменте (~30%) с суммарным электрогенезом в ходе F->O перехода, включающим в себя транмембранный перенос двух зарядов на электрон. 2. Проведено предварительное исследование прямым электрометрическим методом предстационарной кинетики одноэлектронного фотовосстановления цитохромоксидазы ba3-типа из Thermus thermophilus в состоянии OH в условиях множественных последовательных вспышек (инъекций) электрона с целью выяснения сравнительной электрогенности одноэлектронных переходов (OH->EH и EH->R) в восстановительной части каталитического цикла цитохромоксидазы ba3. Установлено, что электрогенный ответ, относящийся к переходу OH->EH в цитохромоксидазе ba3-типа из Thermus thermophilus, характеризуется микросекундной и миллисекундной компонентами с характеристическими временами (~10-20 мкс и ~0.4-0.6 мс) и соотношением амплитуд (1:2). Быстрая электрогенная компонента сходна по скорости с переносом электрона на низко-спиновый гем b от CuA, в то время как медленная фаза связана по-видимому с переносом протона, сопряженного с реокислением гема b биядерным центром и переносом электрона на CuB. Установлено, что по мере роста числа вспышек (инъекций электрона), наряду с электрогенными событиями в ходе OH->EH перехода наблюдается постепенное накопление состояния EH и возникновение в части популяции фермента электрогенных событий, вызванных переходом в двухэлектронное состояние (EH->R). В результате наблюдается изменение соотношения цианид-чувститвельных миллиcекундных электрогенных фаз, характеризующих электрогенный перенос протонов в ферменте, к амплитуде микросекундной электрогенной фазы, отражающей перенос восстановление низко-спиногового гема b от CuA. Для вычленения параметров электрогенных фаз, сопряженных с переходом EH->R в ферменте, необходимо продолжение исследования. 3. Проведено предварительное исследование быстрой кинетики окисления кислородом полностью восстановленной цитохромоксидазы caa3-типа из Thermus thermophilus с помощью разрешенной во времени оптической спектроскопии. Анализ массива спектрально-кинетических данных в видимом диапазоне выявляет не менее 7 кинетических компонент.