ИСТИНА

Непосредственное наблюдение эволюции – непростая исследовательская задача. По меркам человеческой жизни средние темпы эволюционных преобразований живых систем крайне малы. Тем не менее, для ряда видов оказывается возможным подобрать экспериментальные условия, в которых скорость накопления мутаций весьма велика. Нашей научной группе удалось найти такой объект – это аскомицетный гриб Podospora anserina (Rabenh.) Niessl, подобрать подходящие условия – непрерывный рост мицелия в жидкой питательной среде, а также продемонстрировать, что в данной модельной системе идет положительный отбор de novo мутаций. Планируемая работа представляет собой продолжение и дальнейшее развитие уже начатого исследования. Она призвана выявить механизмы эволюционных преобразований в культуре гриба на более длительном промежутке времени. Настоящий эволюционный эксперимент был заложен в 2012 году на кафедре микологии и альгологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова и продолжается по сей день. Мы поддерживаем непрерывный рост 8 независимых линий P. anserina путем периодических серийных пассажей. По прошествии 4 лет после начала эксперимента методом полногеномного секвенирования «следующего поколения» (NGS) у данных линий суммарно выявлено 128 высокочастотных однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs) – кандидатов в точечные мутации. Среди них 11 были идентифицированы как синонимические, 52 – как несинонимические, 8 – как нонсенс-мутации (стоп-кодон), остальные 57 замен попали в некодирующие и непроаннотированные области. В пользу адаптивности, как минимум, части мутаций говорит, во-первых, явное обогащение последовательностей ДНК несинонимическими и нонсенс-мутациями, в том числе подтвержденное при помощи пермутаций, во-вторых, – накопление замен в одних и тех же генах (в основном – в разных их сайтах) у независимых экспериментальных линий P. anserina. Последний факт есть также пример параллельной эволюции. Продолжение данной работы позволит выявить дополнительные генетические изменения в экспериментальных линиях и их возможные влияния на морфофизиологические характеристики гриба.

It is not easy for investigators to observe evolution directly. By the standards of human life the average rates of evolution in living systems are extremely low. However, it has been possible for some species to find experimental conditions in which the rate of mutations accumulation is rather high. Our scientific group is managed to find such an organism – it is ascomycetous fungus Podospora anserina (Rabenh.) Niessl. Also we have chosen appropriate conditions – it is continuous growth of fungal mycelium in liquid nutrient medium. Additionally we demonstrated that positive selection of de novo mutations occurs in our model system. Planned work represents as continuation and further development of the investigation already started. The work will aim at identifying some mechanisms of evolutionary changes in fungal culture for longer time period. The present evolution experiment was started in 2012 at Department of Mycology and Algology, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, and continues to this day. We provide continuous growth of 8 independent lines of P. anserina by serial passages. Four years after starting the method of next generation sequencing for whole genome analysis lets us revealed 128 single nucleotide polymorphisms (SNPs) as candidates for point mutations fixed in experimental subcultures in total. Functional analysis of SNPs founded revealed 11 synonymous substitutions, 52 missense and 8 nonsense mutations. The other 57 nucleotide changes are located at non-coding and non-annotated regions. In favor of adaptability at least some of mutations we could mention two observations. At first, obvious enrichment of P. anserina DNA by missense and nonsense mutations occurs, as was confirmed by making permutations. Second, different subcultures of P. anserina accumulate changes in the same genes (mainly in various parts). The last mentioned fact is also bright example of parallel evolution. Continuation of this work will help to identify additional genomic changes in P. anserina experimental lines as well as their possible influence on morphological and physiological features of the fungus.

В 2018 году будет вестись работа по двум из трех заявленных блоков – геномному и физиологическому. Морфологический блок – анализ ультраструктуры будет отнесен ко 2-му и 3-му году проекта. К концу 2018 года мы планируем отсеквенировать полный геном образцов 8 экспериментальных линий P. anserina из очередной временной точки, что соответствует 400-му пассажу. Также будет проведен сравнительный анализ всех полученных последовательностей. В результате выполнения заявленной на 2018 год части проекта мы сможем установить скорость накопления мутаций в геномах линий P. anserina, поддерживаемых в неизменных условиях, а также выяснить их характер. Будет изучено распределение выявленных однонуклеотидных отличий от генома дикого штамма по функциональным категориям. Для этого выявленные мутации (полиморфизмы) будут разделены на классы в зависимости от того, в какой сегмент генома они попадают (экзоны, интроны или межгенные интервалы). Мутации, изменяющие последовательность экзонов, будут классифицированы как несинонимические (изменяющие аминокислотную последовательность кодируемого геном белка) и синонимические (не приводящие к изменению аминокислотной последовательности). Интерес для анализа представляют, в первую очередь, мутации, меняющие белковую последовательность, поскольку в отличие от большинства синонимических мутаций, они проявляются фенотипически и с большой вероятностью могут находиться под действием естественного отбора. Синонимические мутации также могут оказывать эффект на приспособленность, например, в связи с тем, что разные кодоны, кодирующие одну и ту же аминокислоту, могут транслироваться с разной эффективностью. Однако поскольку под действием отбора значительно чаще находятся несинонимические мутации, поиск мутаций этой группы в геномах производных линий является одной из первостепенных задач проекта. Кроме того, планируется исследовать обогащение несинонимическими мутациями генов, вовлечённых в различные биологические процессы. Большой интерес представляют также мутации, меняющие последовательность некодирующих регуляторных элементов. Однако, поскольку аннотация регуляторных элементов для генома P. anserina отсутствует, разделение мутаций, попадающих в некодирующие участки генома, с точки зрения их возможного эффекта на приспособленность, является затруднительным. Тем не менее, планируется проанализировать, как часто мутации в производных линиях попадают в некодирующие области, находящиеся на небольшом расстоянии от старта транскрипции генов. Также интересным является поиск параллелизмов в эволюции разных линий. С учётом небольших времён культивирования попадание мутаций в одни и те же гены в разных линиях является очень маловероятным событием; более вероятно закрепление мутаций в генах, выполняющих схожие функции или принадлежащих к одним и тем же биохимическим путям. Возникновение параллелизмов в эволюции независимых линий на уровне генов, биохимических путей или биологических процессов может указывать на действие положительного отбора. В связи с этим изучение параллелизмов является одной из интереснейших задач проекта. Не всегда возможно провести прямую параллель между накоплением замен в ДНК и непосредственно наблюдаемыми изменениями фенотипа. Однако если они затрагивают базовый метаболизм, это может быть установлено. Поэтому тест на сужение круга потребляемых субстратов также представляет немалый интерес в настоящей работе.

Непрерывный рост 8 независимых линий P. anserina поддерживается за счет периодических серийных пассажей в жидкую питательную среду. В 2018 г. продолжительность эксперимента составит 6 лет. К настоящему времени проведено более 350 единовременных пассажей. Скорость роста изолятов из глубинных культур остается практически неизменной по сравнению с диким типом (5–7 мм/сут), несмотря на продолжительное культивирование в погруженных условиях. При этом изоляты так же быстро оккупируют козий навоз (естественный природный субстрат P. anserina), как и синтетическую среду. Однако, хотя и с разной скоростью, они становятся стерильными. Проведен поиск уникальных высокочастотных однонуклеотидных полиморфизмов (однонуклеотидных мутаций) у всех восьми экспериментальных линий P. anserina. Среди них 11 были идентифицированы как синонимические, 52 – как несинонимические (миссенс-мутации), 8 – как нонсенс-мутации (стоп-кодон), остальные 57 замен попали в некодирующие и непроаннотированные области. Все полиморфизмы, попавшие в кодирующие области, относятся к белкам с полной аннотацией (с целиком определенными экзонами). Ни один из полиморфизмов не попал в интроны. Таким образом, наша гипотеза (Кудрявцева и др., 2011) о накоплении у P. anserina генетических изменений в условиях длительного культивирования в жидкой среде полностью подтвердилась. Количество мутаций в условиях эксперимента увеличивается с возрастанием числа пересевов в свежую среду и, соответственно, с увеличением числа клеточных делений – подобно тому, как это имело место в классических экспериментах, поставленных на E. coli (Lenski et al., 2015). Результаты функциональной аннотации затронутых мутациями генов позволяют с большой долей уверенности предполагать, что они так или иначе связаны с процессами роста и размножения P. anserina. Продолжение данной работы позволит выявить дополнительные генетические изменения в экспериментальных линиях и их возможные влияния на морфофизиологические характеристики гриба.