ИСТИНА

Целями проекта являются установление механизма транспорта и путей эволюции транспортной специфичности мембранных РРаз, а также принципов регуляции метаболически связанных CBS-пирофосфатаз. Конкретно, к концу 2015 г. предусмотрено: получить в чистом виде одну-две мРРазы и реконструировать их в липосомы в функциональном состоянии, построить обновленное филогенетическое дерево суперсемейства мембранных РРаз, идентифицировать новое подсемейство К+-независимых мРРаз, детально охарактеризовать диаденозинполифосфаты АрnА с n = 3-6 как регуляторы CBS-РРаз, в случае благоприятного исхода получить кристаллы полноразмерной CBS-РРазы.

За прошедший год мы разработали метод очистки и реконструкции в липосомах трех мРРаз с разной транспортной специфичностью: Na+-транспортирующей РРазы Thermotoga maritima, H+-транспортирующей РРазы Streptomyces coelicolor и Na+,H+-транспортирующей РРазы Bacteroides vulgatus. Для очистки мРРаз методом металлохелатной хроматографии в их структуру была введена гистидиновая вставка на N- или C-конце. Выбор места введения вставки был определен опытным путем с таким расчетом, чтобы минимизировать влияние вставки на гидролитическую и транспортную активности. Успех этого подхода связан с тем, что N- или C-концы пространственно отделены от ядра белка, формирующего гидролитический центр и транспортный канал. Полученный белок был практически гомогенным и после реконструкции в липосомах катализировал гидролиз пирофосфата и пирофосфат-зависимый транспорт Na+. Гидролитическая активность была чувствительна к специфическому ингибитору мРРаз – аминометилендифосфонату. Аналогичные результаты были получены с двумя другими мРРазами. Полученные системы будут использованы для изучения механизма транспорта катионов этими уникальными переносчиками. Ген(ы) мембранной пирофосфатазы присутствуе(ю)т в более чем 700 секвенированных геномах прокариот, и только 26 из них были экспрессированы и охарактеризованы на предмет катионной специфичности транспорта. Из общего числа охарактеризованных мРРаз 16 принадлежат к Н+-РРазам, 7 к Na+-РРазам и 3 к Na+,H+-РРазам. Разумный выбор мРРаз для характеристики позволил определить основные подсемейства мРРаз на филогенетическом дереве [Baykov et al. (2013) MMBR 77, 267-276]. Тем не менее, остались пограничные районы между семействами, содержащие мРРазы с неизвестной специфичностью. А как раз они представляют особый интерес для выяснения путей эволюции катионной специфичности. Согласно нашей гипотезе, первыми появились Na+-РРазы, которые затем эволюционировали в Na+,H+-РРазы и Н+-РРазы. Если это верно, то пространство на филогенетическом дереве вблизи ветви Na+,H+-РРаз может содержать Na+-РРазы с возрастающей способностью транспортировать Н+ в присутствии Na+. Это предположение было подтверждено в отчетный период открытием Na+-РРазы бактерии Clostridium phytofermentans (Cp-PPазы), сохраняющей способность транспортировать Н+ при концентрации Na+ 50 мМ (рис. 2). Следует иметь в виду, что канонические Na+-РРазы, в принципе, имеют Н+-транспортную активность, но она полностью подавляется при физиологической концентрации Na+ 10 мМ (Tm-РРаза на рис. 2). В дальнейшем мы охарактеризуем целый набор мРРаз переходного типа между Na+-РРазой Thermotoga maritima и Na+,H+-PPase Bacteroides vulgatus, чтобы идентифицировать остатки, мутации которых связаны с изменением транспортной специфичности мРРаз. В рамках изучения открытого нами в прошлом году эволюционно-удаленного семейства К+-независимых Н+-транспортирующих мРРаз было обнаружено, что гидролитическая активность двух представителей этого семейства ингибируется избытком субстрата (пирофосфата). Мы проверили в этом отношении мРРазы всех известных типов и обнаружили, что этот эффект универсален для всех мРРаз. На основании этих наблюдений высказана гипотеза о взаимозависимом функционировании активных центров в димерных мРРазах. Поверка этой гипотезы, которая является аналогом «ротационного» механизма Н+-транспортирующих АТРаз, ляжет в основу работ по установлению механизма сопряжения гидролиза и транспорта в мРРазе.