ИСТИНА

Амфифильные сополимеры, в которых звенья малеиновой кислоты чередуются с гидрофобными звеньями стирола или диизобутилена (maleic acid-containing alternating copolymers, MACPs) обеспечили методический прорыв в изучении мембранных белков. Несколько сополимеров малеиновой кислоты оказались способны экстрагировать мембранные белки из природных и искусственных мембран - в отсутствие детергентов - с образованием дисковидных липопртеиновых частиц с диаметром в диапазоне 10-30 нм, стабилизированных амфифильными сополимерами. Ферменты сохраняют активность внутри MACP-частиц; поэтому такие частицы позволяют исследовать даже неустойчивые к детергентам мембранные ферменты методами, для которых необходивы гомогенные водные растворы исследуемых ферментов. MACP-липодиски также весьма интересны с методической точки зрения как объекты для изучения пространственной структуры не кристаллизующихся мембранных белков в экспериментах с единичными молекулами или их комплексами с использованием, например, рентгеновских лазеров на свободных электронах или криоэлектронной микроскопии. Тем не менее, остается неясным, каким образом MACP экстрагируют мембранные белки в отсутствие детергентов, как взаимодействуют функциональные группы полимера, липиды и белки между собой, какое влияние липодиск оказывает на крупномасштабную конформационную динамику белка. Липодски имеют существенное преимущество перед используемыми для похожих целей липидными нанодисками. При получении нанодисков используются детергенты, и стабилизирующим их агентом является каркасный белок (membrane scaffold protein, MSP). MSP охватывает по периметру фрагмент липидного бислоя, который может содержать мембранный белок или белковый комплекс. О структуре липодисков, в отличие от нанодисков, известно немного. Наши предварительные исследования и оценки показывают, что простой механизм формирования структуры с охватом куска бислоя длинной полипептидой (белковой) цепью, как в случае нанодисков, является для липодисков практически невозможным ввиду относительно небольшой длины полимерных цепей, а также сильного электростатического отталкивания двукратно отрицательно заряженных остатков малеиновой кислоты. Вместе с тем, структуры липодисков достаточно хорошо стабилизированы, хорошо воспроизводятся, не содержат ―лишних‖ белковых структур (кроме изучаемого мембранного белка) и весьма перспективны для решения задач структурной биологии. В предлагаемом проекте в сотрудничестве с лабораторией профессора Штайнхоффа (Оснабрюкский университет, Германия) предлагается изучить структуру липодисков (с мембранным белком и без него) и их влияние на динамику белка. В качестве функционального детектора будет использован комплекс сенсорного родопсина II и сопряженного с ним белка-трансдюсера из архей. Этот комплекс, хорошо изученный немецкими партнерами, будет использоваться для исследования влияния различных полимеров на его структуру и механизм передачи сигнала. В то время как усилия немецкой группы будут сосредоточены на разработке методов приготовления липодисков, их характеризации методами гель-проникающей хроматографии, динамическим рассеянием света, просвечивающей электронной микроскопией, а также оптической и ЭПР-спектроскопией, в российской группе упор будет сделан на исследования липодисков методами электронной микроскопии с мечением наночастицами, томографии, и АСМ. Параллельно будет проведено полноатомное и крупнозернистое молекулярно-динамическоее моделирование со сравнительной оценкой вкладов различных типов взаимодействий в стабилизацию структуры липодисков (гидрофобных, электростатических и стекинг взаимодействий). Сопоставление структурных данных, обнаруженных методами электронной микроскопии с мечением наночастицами, и детальной структуры липодисков, полученных в рамках различных протоколов молекулярного моделирования, предоставит информацию о механизме формирования и стабилизации липодисков.

Amphiphilic copolymers in which the maleic acid units alternate with the hydrophobic units of styrene or diisobutylene (MACPs) provided a methodological breakthrough in the study of membrane proteins. Several copolymers of maleic acid were able to extract membrane proteins from natural and artificial membranes-in the absence of detergents-to form discoid lipoprotein particles with a diameter in the range of 10-30 nm stabilized with amphiphilic copolymers. Enzymes retain activity within the MACP particles; therefore, such particles allow us to investigate even membrane enzymes that are unstable to detergents by methods for which homogeneous aqueous solutions of the enzymes are needed. MACP lipodisks are also very interesting from a methodological point of view as objects for studying the spatial structure of non-crystallizing membrane proteins in experiments with single molecules or their complexes using, for example, free-electron X-ray lasers or cryoelectron microscopy. Nevertheless, it remains unclear how MACP extracts membrane proteins in the absence of detergents, how the functional groups of the polymer, lipids and proteins interact with each other, what effect the lipodisk has on the large-scale conformational dynamics of the protein. Lipods have a significant advantage over lipid nanodisks used for similar purposes. When preparing nanodisks, detergents are used, and the stabilizing agent is the membrane scaffold protein (MSP). MSP encompasses around the perimeter a fragment of a lipid bilayer that can contain a membrane protein or a protein complex. Little is known about the structure of lipodiscs, in contrast to nanodisk. Our preliminary studies and evaluations show that a simple mechanism for the formation of a structure with a long polypeptide (protein) chain, as in the case of nanodisks, is practically impossible for lipodiscs due to the relatively short length of polymer chains, as well as strong electrostatic repulsion of doubly negatively charged maleic residues acid. At the same time, lipodisc structures are well stabilized, reproduce well, do not contain "extra" protein structures (except for the membrane protein being studied) and are very promising for solving structural biology problems. In the proposed project, in cooperation with Professor Steinhoff's laboratory (Osnabruck University, Germany), it is proposed to study the structure of lipodysk (with and without a membrane protein) and their effect on protein dynamics. As a functional detector, a complex of sensory rhodopsin II and a conjugated transduced protein from archaea will be used. This complex, well studied by German partners, will be used to investigate the influence of various polymers on its structure and the mechanism of signal transmission. While the efforts of the German group will focus on the development of methods for preparing lipodiscs, their characterization by gel permeation chromatography, dynamic light scattering, transmission electron microscopy, and optical and EPR spectroscopy, the Russian group will focus on lipodisk studies using electronic microscopy with nanoparticle labeling, tomography, and AFM. In parallel, a comprehensive and coarse molecular dynamics simulation with a comparative evaluation of the contributions of various types of interactions to the stabilization of the lipodisk structure (hydrophobic, electrostatic, and stacking interactions) will be conducted. Comparison of structural data detected by electron microscopy with nanoparticle labeling and a detailed structure of lipodisk obtained in the framework of various molecular modeling protocols will provide information on the mechanism of formation and stabilization of lipodiscs.

Изучение структуры и механизмов образования в растворе липодисков, содержащих мембранные белки и стабилизированных амфифильными сополимерами малеиновой кислоты (maleic acid, MA) и гидрофобных звеньев стирола (SMA) или диизобутилена (DIBMA), см. рис. 1. . По липодискам (в отличие от липид-белковых нанодисков, стабилизированных в растворе аполипротеионом или специальным белком MSP) имеется относительно мало работ, механизм их образования мало изучен, хотя эти объекты представляют значительный интерес с точки зрения структурной биологии и проведения экспериментов с единичными молекулами или их комплексами, например, с использованием рентгеновских лазеров, а также криоэлектронной микроскопии.

У коллектива имеется большой экспериментальный и теоретический задел по тематике предлагаемого проекта. В частности, были разработаны протоколы и методы молекулярной динамики многокомпонентных систем, проведены исследования по молекулярному моделированию биомембран различного состава и в различных приближениях, динамике формирования рафтов на биомембранах, динамике транспортных процессов через биомембраны, динамике функционирования ионных каналов, динамике формирования ДНК-белковых комплексов, механическим свойствам клеточных стенок и др. (см., например, [1-32]). Авторами проекта была также проведена предварительная работа по моделированию структуры липодисков, которая показала, что ситуация в данном случае весьма нетривиальная и существенно отличается от ситуации с липид-белковыми нанодисками, которые стабилизированы специальными белковыми цепями, охватывающими нанодиск по периметру. Это обстоятельство делает изучение структуры липодисков особенно интересным и интригующим. Для определения структуры мембранных белков методами электронной микроскопии разработаны подходы, сочетающие обработку получаемых изображений с методами молекулярного моделирования и впервые определена пространственная структура ионного канала Kv10.2 и его субъединиц [32,33]. Для изучения взаимодействия белков с липидами был разработан крио-подход. Разработка осуществлена на примере мутантного грамицидина [Lys3]gA, который, как мы впервые показали, образует кластеры в липидных мембранах [34]. Липосомы с белком замораживали и изучали в крио-электронном микроскопе. Отдельные участки липосом вырезали в программе BOXER [А] и выравнивали относительно общей суммы для увеличения отношения сигнал/шум. В результате были получены суммарные изображения липидной мембраны без белка, с gA, [Lys3]gA и смесью. Для того, чтобы показать наличие кластеров в образце, содержащем [Lys3]gA, мы раcсчитывали профиль интенсивностей внутри прямоугольника, ограничивающего мембрану.

Развиты теоретические и экспериментальные методы изучения структуры и физико-химических свойств липодисков как перспективной платформы для исследования мембранных белков (ионные каналы, фоточувстви- тельные белки и др.). Установлено соответствие между крупнозернистыми и полноатомными моделями при различных соотношениях между гидрофобных и заряженных групп в полимерах и различном липидном соста- ве. Разработаны методы получения липодисков из мембран клеток прокариот и эукариот, методы характеризации параметров липодисков с использованием ПЭМ, ДЛС и АСМ. Изучена структура липодисков как пустных,так и загруженных мембранным белком на примере ряда ионных каналов. Определены оптимальные варианты хранения препаратов липодисков. Основными результатами заключительного этапа являются: -Были построены модели DIBMA-липодисков различного размера и определено, что диски с диаметром менее 40 нм сохраняют в водном окружении плоскую циркулярную форму. Диски большего размера претерпевают значительное искривление. -Динамика липидов в липодисках не зависит от их размера в исследованном диапазоне размеров (25-35 нм). -В липодисках со сложным липидным составом отрицательно заряженные липиды, POPS и POPE, концентрируются в центральной части дисков. -Липодиски, сформированные SMA и DIBMA полимерами, не вызывают существенных конформационных перестроек в двух изученных белковых комплексах, EcNarQ и NpHtrII:SRII. -Построена трехмерная модель сенсора клеточной стенки Wsc1 дрожжей с применением методов электронной микроскопии и бездетергентной солюбилизации в SMA-липодисках. Предложена новая гипотеза функциони- рования этого мембранного сенсора. -Показано, что размеры солюбилизированных мембран-белковых частиц, полученных с использованием SMA и классического детергента (CHAPS) обладают различными размерам.