|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ФНКЦ РР |
||
Сравнительный анализ масс-спектрометрической идентификации белков в ядерной и митохондриальной фракциях печени крыстезисы доклада
- Авторы: Емельянова А.А., Буник В.И.
- Сборник: Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2024»
- Редакторы: Алешковский Иван Андреевич, Андриянов Андрей Владимирович, Антипов Евгений Александрович, Зимакова Екатерина Игоревна
- Серия: Экономика
- Тезисы
- Год издания: 2024
- Издательство: МГУ
- Местоположение издательства: Москва
- Аннотация: Масс-спектрометрическая (МС) идентификация белковых пептидов зависит от состава пробы, что затрудняет сравнительный анализ представленности белков при разном белковом составе образцов. Цель нашей работы – оценить вклад данного фактора в масс-спектрометрическую идентификацию пептидов белков с множественной внутриклеточной локализацией в субклеточных фракциях. В качестве таких белков мы рассмотрели традиционно митохондриальные ферменты - дегидрогеназы 2-оксокислот (ДГОК), для которых в независимых исследованиях была показана и ядерная локализация, и истинно митохондриальные белки фумаразу – единственный фермент цикла трикарбоновых кислот, не обнаруженный в ядре и СОХ IV. Печень гомогенизировали в среде выделения митохондрий и фракционировали клеточное содержимое на ядерную, цитоплазматическую и митохондриальную фракции по опубликованной методике. Чистоту ядерной и митохондриальной фракций оценивали методом Вестерн-блоттинга по экспрессии митохондриального маркера COX IV и по ацетилированию гистон-содержащей фракции белков с использованием первичных антител Abcam ab153709 (разведение 1:2000) и CST 9814 (разведение 1:2000), соответственно. Имунноблоттинг также применяли для оценки экспрессии ДГОК во фракциях с использованием первичных антител к OGDH (разведение 1:2000, ThermoFisher PA5-28195), DHTKD1 (разведение 1:400, ThermoFisher PA5-24208), PDHA (разведение 1:1000, CST 3205). В качестве вторичных использовали антитела козы к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с пероксидазой (разведение 1:5000, Имтек #P-GAR Iss). С помощью Вестерн-блоттинга была показана относительная чистота ядерной и митохондриальной фракций: уровень ацетилирования белков 10-15 кДа был существенно выше в ядерной фракции, а экспрессия COX IV - в митохондриальной. Сравнительный анализ пептидных карт ДГОК, фумаразы и COX IV в ядерной и митохондриальной фракциях показал, что некоторые из белков интереса (PDHA, PDHВ) определяются в обеих фракциях сходным образом, тогда как для других (OGDH, DHTKD1, фумараза, СОХ IV) наблюдаются существенные различия в идентифицируемых во фракциях пептидах и их количестве, не всегда совпадающие с данными иммуноблоттинга. Поэтому отношение процента покрытия белка идентифицированными пептидами к его массе или сумма наиболее хорошо определяемых в каждой фракции площадей пиков пептидов не могут использоваться для количественного сравнения представленности белков в разных фракциях. Невозможно и нормирование белковой экспрессии на белки, пептиды которых определяются во фракциях по-разному (СОХ IV, фумараза). Тем не менее, в отличие от митохондриального маркера СОХ IV, представленности ДГОК в ядерной и митохондриальной фракциях по данным МС и по данным иммуноблоттинга сопоставимы, тогда как в цитоплазматической фракции ДГОК практически отсутствуют. Таким образом, количественное сравнение представленности белков с помощью МС даже в составе субклеточных фракций одной ткани затруднено из-за потенциальных различий в идентификации пептидов. Однако для некоторых белков такие различия не выражены, что позволяет характеризовать их наличие во фракциях, особенно при усреднении данных по пептидам, одинаково хорошо определяемым в обеих фракциях. Основанный на идентификации пептидов МС подход можно применить для оценки влияния факторов, потенциально вызывающих перераспределение белков между клеточными компартментами.
- Добавил в систему: Емельянова Алина Антоновна